H PLC同時(shí)測定復(fù)方雞骨草膠囊中綠原酸、芍藥苷和梔子苷的含量

羅國瓊

（廣西金嗓子有限責(zé)任公司，廣西柳州 545001）

H PLC同時(shí)測定復(fù)方雞骨草膠囊中綠原酸、芍藥苷和梔子苷的含量

羅國瓊

（廣西金嗓子有限責(zé)任公司，廣西柳州 545001）

目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測定復(fù)方雞骨草膠囊中綠原酸、芍藥苷、梔子苷的含量。方法：采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；檢測波長為0～21 min：327 nm，21～27 min：238 nm，27～40 min：230 nm。結(jié)果：綠原酸線性范圍為0.036 1～0.902 5 μg，平均加樣回收率為97.74%，RSD為1.40%（n=6），梔子苷線性范圍為0.148 2～5.929 6 μg，平均加樣回收率為97.68%，RSD為1.14%（n=6），芍藥苷線性范圍為0.098 9～3.954 8 μg，平均加樣回收率為97.70%，RSD為0.99%（n=6）。結(jié)論：該方法簡便可行，結(jié)果可靠，可有效控制復(fù)方雞骨草膠囊的質(zhì)量。

復(fù)方雞骨草膠囊；綠原酸；芍藥苷；梔子苷；HPLC

WORDSCompound Jigucao Capsule；Chlorogenic Acid；Paeoniflorin；Geniposide；HPLC

復(fù)方雞骨草膠囊由茵陳、梔子、白芍、毛雞骨草、人工牛黃、珍珠層粉等中藥制成，具有清利肝膽濕熱的功效。臨床主要用于肝膽濕熱所致的脅肋不舒，脘腹脹滿，疲倦乏力，口苦尿黃等癥。為提高其質(zhì)量可控性，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定了制劑中君臣藥茵陳、梔子及白芍的有效成分綠原酸、芍藥苷、梔子苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200系列液相色譜儀，Waters e2695型液相色譜儀，Shimadzu UV-2405紫外-可見分光光度計(jì)，必能信BUG-40超聲儀，AND GR-202電子分析天平。

1.2 試藥

復(fù)方雞骨草膠囊及分別不含茵陳、梔子、白芍的陰性樣品由廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供；對照品綠原酸（110753-200413）、芍藥苷（110736-201136）、梔子苷（110749-200714）購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，其余所用試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈A-0.1%磷酸溶液B按表1梯度洗脫；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～21 min：327 nm，21～27 min：238 nm，27～40 min：230 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

表1 流動(dòng)相變化梯度

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備分別精密稱取綠原酸、梔子苷、芍藥苷對照品適量，加70%甲醇制成濃度分別為18.05，148.24，98.87 μg/mL的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備取復(fù)方雞骨草膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（250 W，50 kHz）30 min，取出放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液同供試品溶液方法制備。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察取綠原酸對照品，用70%甲醇制成濃度分別為3.61，7.22，18.05，36.1，72.2，90.25 μg/mL的系列溶液，分別進(jìn)樣10 μL，在擬定的色譜條件下測定，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程

表明綠原酸進(jìn)樣量在0.036 1～0.902 5 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

另取梔子苷對照品系列溶液（濃度為14.824，29.648，59.296，148.24，296.48，592.96 μg/mL），芍藥苷對照品系列溶液（濃度為9.887，19.774，39.548，98.87，197.74，395.48 μg/mL），同綠原酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得回歸方程

圖1 復(fù)方雞骨草膠囊HPLC圖

表明梔子苷進(jìn)樣量在0.148 2～5.929 6 μg范圍內(nèi)、芍藥苷進(jìn)樣量在0.098 9～3.954 8 μg范圍內(nèi)均有較好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn)精密吸取混合對照品溶液（綠原酸：18.05 μg/mL、梔子苷：148.24 μg/mL、芍藥苷：98.87 μg/mL）10 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果綠原酸峰面積的平均值為252.8，RSD為0.51%，梔子苷峰面積平均值為1 444.1，RSD為0.38%，峰面積平均值為560.4，RSD為0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號（批號：360041）的供試品溶液，分別在0，2，4，8，10，16，24 h進(jìn)樣1次，測定峰面積。結(jié)果綠原酸峰面積平均值為256.1，RSD＝1.37%（n=7）；梔子苷峰面積的平均值為1666.5，RSD＝0.86%（n=7）；芍藥苷峰面積的平均值為527.8，RSD＝1.31%（n=7）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批樣品內(nèi)容物（批號為360041），平行制備6份供試品溶液，按擬定色譜條件在Waters e2695型液相色譜儀上測定其含量。結(jié)果綠原酸含量平均值為0.235 5 mg/粒，RSD為1.19%；梔子苷含量平均值為2.132 0 mg/粒，RSD為0.88%；芍藥苷含量平均值為1.132 3 mg/粒，RSD為0.96%，由此可見本法重現(xiàn)性較好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的本品內(nèi)容物1.0 g（批號：360041），精密稱定，共18份，每6份分別精密加入綠原酸、梔子苷、芍藥苷對照品適量，按供試品溶液制備方法制成供試液，依照所擬色譜條件測定。結(jié)果見表2，3，4。

2.3.6 專屬性實(shí)驗(yàn)分別取缺茵陳、梔子、白芍的陰樣對照溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果分別在綠原酸、梔子苷、芍藥苷峰的相應(yīng)位置上未檢出相應(yīng)的色譜峰，表明本法專屬性較好。見圖1。

表2 綠原酸加樣回收率測定結(jié)果

表3 梔子苷加樣回收率測定結(jié)果

表4 芍藥苷加樣回收率測定結(jié)果

2.4 樣品含量測定

取復(fù)方雞骨草膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，照2.2項(xiàng)下制備方法制成供試液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果批號為360041，360044，360045，360047，360049的樣品中綠原酸的含量分別為0.235 5，0.240 8，0.246 7，0.227 0，0.231 7 mg/粒；梔子苷的含量分別為2.1320，2.113 6，2.146 0，2.526 8，2.430 9 mg/粒；芍藥苷的含量分別為1.132 3，1.216 6，1.210 7，1.156 4，1.035 5 mg/粒。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

根據(jù)綠原酸、梔子苷、芍藥苷的各自紫外掃描圖譜，同時(shí)參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]所用波長，分別選用其最大吸收波長327，238，230 nm作為其檢測波長，在各自的洗脫時(shí)間內(nèi)利用可變紫外檢測器自由變換成各自的最大吸收波長，從而得到最理想的色譜峰。

3.2 流動(dòng)相的選擇

采用HPLC分別測定綠原酸、梔子苷、芍藥苷含量的流動(dòng)相很多，有甲醇-水，甲醇-磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-磷酸溶液等[1-15]。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)考察比較，要使三種成分在復(fù)方制劑中同時(shí)分離，需采用梯度洗脫才能取得較滿意的結(jié)果，本法最終選定的流動(dòng)相系統(tǒng)可使綠原酸、梔子苷、芍藥苷均能達(dá)到基線分離，與其他峰分離度大于1.5，理論板數(shù)均大于6 000。

3.3 供試品溶液的制備方法考察

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-15]，采用了甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇等不同的溶劑提取，同時(shí)比較了加熱回流、浸泡與超聲處理等不同的提取方法，結(jié)果表明選用70%甲醇與50%甲醇回流與超聲提取均可以使3種有效成分完全提取出，但50%甲醇溶液過濾較為困難，文中所用方法最為方便、快捷，因此選用。

本研究采用HPLC同時(shí)測定復(fù)方雞骨草膠囊中綠原酸、梔子苷和芍藥苷的含量，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，專屬性強(qiáng)，精密度、回收率均較好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

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Simultaneous Determination of Contents of Chlorogenic Acid,Paeoniflorin and Geniposidein Compound Jigucao Capsules by HPLC

Luo Guoqiong（Guangxi Golden Throat Co.LTD.，Guangxi Liuzhou 545001，China）

Objective:To establish a method for the content determination of chlorogenic acid，paeoniflorin and geniposide in compound jigucao capsules.Methods:Agilent TC-C18column（4.6mm×150mm，5 μm）was adopted with acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution as mobile phase，gradient elution，a detection wavelength of 0～21 min at 327nm，21～27 min at 238 nm，27～40 min at 230 nm.Results:There was a good linear relationship within the range of 0.036 1～0.902 5 μg for chlorogenic acid，0.148 2～5.929 6 μg for geniposide，and 0.098 9～3.954 8 μg for paeoniflorin.The average recoveries were 97.74%with RSD of 1.40%（n=6），97.68%with RSD of 1.14%（n=6）and 97.70%with RSD of 0.99%（n=6）for chlorogenic acid，geniposide and paeoniflorin respectively.Conclusion: The method was simple and reliable，it can be applied to the quality control of compound jigucao capsules.

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.07.007

2014-04-17）

羅國瓊，女，助理工程師。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析與研究。E-mail：ler630@126.com