均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化白藜蘆醇超臨界CO2流體萃取工藝

方耀平，秦郁文，唐富麗，董自亮

（1.太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 400038； 2.太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000）

白藜蘆醇為一類多酚類物質(zhì)，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，并以虎杖中的含量最高。白藜蘆醇具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[1－2]、抗菌[3]、抗心肌炎[4]以及免疫調(diào)節(jié)[5]等。此外，白藜蘆醇還具有抗輻射誘變損傷、抗衰老等作用，在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。目前從虎杖中提取白藜蘆醇的方法多為有機(jī)溶劑提取，利用白藜蘆醇易溶于極性有機(jī)溶劑的性質(zhì)，將其從原料中提取出來。但是，有機(jī)溶劑提取的粗品中含有大量的植物多糖、黃酮類化合物、色素、酚酸類等多種雜質(zhì)，不利于后續(xù)工序的精制純化，且工序多、工藝煩瑣復(fù)雜；加熱時(shí)間長，使成品顏色加深，產(chǎn)品易氧化變質(zhì)，穩(wěn)定性差；有效成分收率較低；有機(jī)溶劑耗用量大，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題[6]。超臨界流體萃取是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)分離技術(shù)，具有無毒、無殘留溶劑、CO2可循環(huán)使用等優(yōu)點(diǎn)，適合于不穩(wěn)定天然產(chǎn)物和生理活性物質(zhì)的分離與精制，已成為醫(yī)藥、食品和香料等深加工領(lǐng)域中獲得高品質(zhì)產(chǎn)品的最有效手段之一[7]。目前，利用超臨界流體技術(shù)萃取虎杖中白藜蘆醇的報(bào)道尚不多見。為此，本試驗(yàn)中對采用超臨界CO2萃取技術(shù)，采用均勻設(shè)計(jì)法，對從虎杖中萃取分離白藜蘆醇的工藝進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

島津SPD－20A型高效液相色譜儀（LC－20AT）；BP2110型電子天平（德國賽多利斯公司）；SHB－3型循環(huán)水式真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；R－205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；DJ－005型多功能粉碎機(jī)（山東精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）；HA221－50－06型超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）?；⒄容腿∥?批號(hào)為120806，自制)，白藜蘆醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111535－200703）；乙腈、甲醇為色譜級，水為純蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白藜蘆醇含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:水 －乙腈（78 ∶22）；檢測波長:303 nm；流速:1.0 mL /min；柱溫:25 ℃；進(jìn)樣量:10 μL。色譜峰見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的白藜蘆醇對照品3.14 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（0.062 8 g/L）。精密量取對照品貯備液 1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得白藜蘆醇對照品溶液(每1 mL含白藜蘆醇6.28 μg)。取虎杖萃取物4 g，精密稱定，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置后精密量取上清液20 mL，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對照品溶液 2，4，8，12，16，20 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，以白藜蘆醇進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程 Y＝334 331 X －348.6，R2＝0.999 8（n＝7）。結(jié)果表明，白藜蘆醇進(jìn)樣量在0.012 55～0.125 6 μg范圍內(nèi)與面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取白藜蘆醇對照品溶液，依法連續(xù)測定6次，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.61%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批虎杖萃取物（批號(hào)為120806）樣品6份，按依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果白藜蘆醇的平均含量為6.644 mg/g，RSD 為 1.23%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，室溫密閉放置，分別于制備后 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定白藜蘆醇峰面積。結(jié)果的 RSD 為2.25%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品約2 g，共9份，依法制備供試品溶液并定容至200 mL，各取1 mL，分別加入定量的對照品溶液（質(zhì)量濃度為 6.28 μg /mL）2.0，2.5，3.0 mL（約相當(dāng)于樣品量得80%，100%，120%）各3份，分別按擬訂色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 虎杖萃取物中白藜蘆醇加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.2 超臨界CO2萃取工藝條件篩選

2.2.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化超臨界－CO2萃取工藝參數(shù)。結(jié)合文獻(xiàn)[8]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定主要考察因素為萃取壓力（X1）、萃取時(shí)間（X2）、萃取溫度（X3）、夾帶劑（95% 乙醇）用量（X4）；萃取流量無法控制，設(shè)為定值。因試驗(yàn)所用的藥材粒度不便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先用單因素方法考察最佳粒度，經(jīng)含量測定，計(jì)算得以60目的提取效果為最佳。此試驗(yàn)有4個(gè)因素，6個(gè)水平，選用 U6（64）表安排試驗(yàn)，因素水平表見表2，均勻設(shè)計(jì)參數(shù)見表3。每次將250 g虎杖藥材粉（60目）投入萃取釜中，按均勻設(shè)計(jì)表設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行超臨界萃取。

采用 SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)行后，Shapiro－Wilk統(tǒng)計(jì)量為0.888 1，P＝0.308 6＞0.05，模型服從正態(tài)分布，但 P（X1，X2，X3，X4）＞0.05，模型無統(tǒng)計(jì)量，無法建立逐步回歸方程，故建立二次多項(xiàng)式回歸方程，程序再次運(yùn)行后，模型統(tǒng)計(jì)量 F＝147.68，P＝0.001 0＜0.01，逐步回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。調(diào)整決定系數(shù)為R2＝0.983 2，回歸方程效果較好。X3，X1X2的偏回歸系數(shù) t統(tǒng)計(jì)量分別為 3.55，16.09，P 值分別為 0.038 2，0.005，應(yīng)當(dāng)留在方程中。故建立回歸方程為 Y ＝3.022 19 ＋0.024 78X3＋0.0211 7X1X2。

由二次多項(xiàng)式回歸方程，X3，X1X2各項(xiàng)均為正號(hào)，X1，X2，X3應(yīng)取試驗(yàn)范圍的最大值，X4根據(jù)實(shí)際情況取最小值，最優(yōu)點(diǎn)的近似估計(jì)值為 X1＝30，X2＝60，X3＝250，X4＝120。故最優(yōu)方案的近似估計(jì)為萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，夾帶劑用量250 mL（即藥粉量的100%），萃取時(shí)間120 min。

2.2.2 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化條件

根據(jù)均勻設(shè)計(jì)回歸方程，采用SAS 8.0軟件處理，得到了超臨界萃取白藜蘆醇的最優(yōu)化操作條件為，萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，萃取時(shí)間120 min，夾帶劑用量（藥粉用量的100%），萃取率0.096 4%。該試驗(yàn)條件下的方程預(yù)測值為0.097 7%，與實(shí)際值基本相同。

表2 均勻設(shè)計(jì)因素和水平

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

3 討論

均勻設(shè)計(jì)法的特點(diǎn)是將有關(guān)試驗(yàn)的水平數(shù)均勻分散在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，使有限的數(shù)據(jù)具有廣泛的代表性，因此可大幅度減少試驗(yàn)次數(shù)。本研究采用均勻設(shè)計(jì)方法，對超臨界CO2流體萃取虎杖中白藜蘆醇的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，所得超臨界萃取白藜蘆醇的最佳工藝條件為萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，夾帶劑用量100%，萃取時(shí)間120 min。萃取過程中的壓力、溫度的變化對萃取率的影響起主要作用，因此控制好壓力和溫度的參數(shù)顯得尤為重要。超臨界二氧化碳萃取白藜蘆醇，同傳統(tǒng)萃取方式相比較，具有簡便、高效、環(huán)保、產(chǎn)物易于分離等特點(diǎn)，并且能獲得較高的萃取率，是一種很好的白藜蘆醇提取分離方法。此外，本研究建立的測定虎杖中白藜蘆醇含量的高效液相色譜(HPLC)法具有靈敏、準(zhǔn)確、迅速和穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，可用于虎杖中白藜蘆醇的含量測定以及有效成分提取的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn):

[1]雷 波，邵 森.珠子草對乙肝病毒的滅活作用及化學(xué)成分的研究狀況[J].國外醫(yī)學(xué):中醫(yī)中藥分冊，1990，12（6）:25 －28.

[2]Hsieh TC，Wu JM.Differential effects on growth，cell cycle arrest and induction of apoptosis by resveratrol in human prostate cancer cell lines[J].Exp Cell Res，1999，249(1):109 －115.

[3]陰 健，郭力弓.中藥現(xiàn)代化研究與臨床應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社，1993:872.

[4]Yu R，Hebbar V，Kim，et al.Resveratrol in hibits phorbolester and UV －induced activator protein 1 activation by interfering with mitogen－activated protein kinase pathways[J].Mol Pharmacol，2001，60（1）:217.

[5]高 路，袁育康，呂卓人，等.白藜蘆醇的免疫調(diào)節(jié)作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2003，24（2）:121 －123.

[6]蘇文強(qiáng)，楊 磊，李艷杰，等.堿提取法從虎杖中分離白藜蘆醇的研究[J].林產(chǎn)化工通訊，2004，38 （1）:17.

[7]王大為，黃寶璽，劉婷婷.超臨界CO2萃取在玉米亞油酸提取中應(yīng)用的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（7）:219 －222.

[8]江 曙，朱蓉蓉，張 芳，等.虎杖中白藜蘆醇提取方法及工藝的優(yōu)化[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（3）:197 －199.