玉液合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

盧 瓊 ，盛 蓉 ，何珊珊 ，李 靜 ，譚 睿

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072）

玉液合劑是由黃芪、粉葛、五味子、山藥等7味藥組方的中藥制劑，其處方為《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中經(jīng)方玉液湯，益氣生津，潤燥止渴，具有升元?dú)庖灾箍实墓πВ饕糜跉獠徊冀?、腎虛胃燥之消渴，用于治療糖尿病、高血壓、甲亢、慢性胃炎、干燥綜合征、乳腺增生病、流行性出血熱多尿期、小兒夏季熱、尿崩癥、癌癥放療后等屬氣陰兩虛、中焦燥熱者。方中黃芪為君藥，粉葛為主證或主病的主要治療藥物之一，其活性成分為葛根素[1]。針對糖尿病臨床用藥的需要，經(jīng)改劑型制成合劑。為對本制劑進(jìn)行更好的質(zhì)量控制，本試驗中在建立黃芪、粉葛的薄層色譜（TLC）定性鑒別的同時，還對其活性成分葛根素進(jìn)行高效液相色譜（MPLC）法測定。方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立的方法可靠、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性、專屬性強(qiáng)，可作為玉液合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

日本島津LC－6AD高效液相色譜儀；BS－110S型電子分析天平（北京賽多利斯電子天平有限公司）。黃芪甲苷對照品（批號為 110781－200613）、葛根素對照品（純度 96%，批號為110752－200912），均由中國藥品生物制品檢定所提供；玉液合劑樣品由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供（批號為120813，120814，120815）；硅膠G（薄層色譜用，青島海洋化工有限公司制造），甲醇（色譜純），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別（TLC法）

2.1.1 黃芪[2－3]

取本品25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨液，正丁醇液再用正丁醇飽和的水充分洗滌3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺黃芪陰性樣品25 mL，同法制備缺黃芪陰性對照品溶液。另取黃芪甲苷對照品1.03 mg，加甲醇1 mL使溶解，作為對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，分別吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL及對照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一以0.2%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇 －水（12 ∶2.5 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10% 的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈（365 nm）下檢視顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾（見圖1A和B）。

2.1.2 粉葛[2－5]

取本品20 mL，蒸干，殘渣加30%乙醇20 mL，超聲提取30 min，離心（轉(zhuǎn)速2 500 r/min）10 min，取上清液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺粉葛陰性樣品20 mL，同法制備缺粉葛陰性對照品溶液。另取葛根素對照品1.01 mg，加甲醇1 mL使溶解，作為對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄VIB]試驗，分別吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL及對照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一以0.2%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（6∶5∶3∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾（見圖1C）。

2.2 葛根素含量測定（HPLC法）[6-8]

2.2.1 色譜條件

色譜柱:大連中匯達(dá) Hypersil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇 －水（22 ∶78）；流速:1.0 mL/min；檢測波長:250 nm；柱溫:30℃。

2.2.2 溶液制備

精密稱取葛根素對照品2.900 mg，置50 mL容量瓶中，加30% 乙醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液（0.055 68 g /mL）。精密量取樣品溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取不含粉葛的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:按擬訂的色譜條件，精密吸取2.2.2項下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果供試品溶液色譜中葛根素色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按葛根素峰計算不低于4 000，陰性無干擾（見圖2）。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密稱取葛根素對照品0.010 0 g，置50 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，即得0.192 0 g/mL的母液。分別精密量取母液 0.5，1.0，2.0，4.0，2.5 mL，置 100，50，25，25 mL，10 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得葛根素對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為 0.000 96，0.003 84，0.015 36，0.030 72，0.048 00 mg /mL）。照擬訂的色譜條件，分別精密吸取各對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程r＝3 678 857 X ＋2 211，r＝1.000 0(n＝5)。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在0.0 096～0.4 800 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:按擬訂的色譜條件，精密吸取質(zhì)量濃度為0.04 800 g/L的葛根素對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果平均峰面積為 1 773 260，RSD ＝0.20%（n＝6）。表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:按擬訂的色譜條件，精密吸取同一供試品溶液10 μL，于 0，2，4，8，12，24 h 注入液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果平均峰面積為546 139，RSD＝0.48%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:精密量取同一批樣品溶液2 mL，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果葛根素平均含量為 0.075 41 g/L，RSD ＝0.44%（n＝6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:精密量取已知含量的樣品溶液（0.075 41 g/L）1 mL，共6份，分別精密加入對照品溶液（0.0 144 g/L）5 mL，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，按擬訂的色譜條件，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，每批2份，分別精密量取2 mL，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按擬訂的色譜條件測定，計算葛根素的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定（g/L）

2.3 粉葛飲片中葛根素含量測定

取粉葛飲片粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇250 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過。取續(xù)濾液，按 2.2.1 項下色譜條件測定，結(jié)果見表3?？梢?，樣品中試3批所用的粉葛飲片中葛根素含量為 3.066 mg/g，符合 2010 年版《中國藥典（一部）》粉葛項下飲片的相關(guān)規(guī)定。

表3 粉葛飲片中葛根素含量測定(n＝3)

3 討論

在定性鑒別時，除對黃芪和粉葛進(jìn)行鑒別外，對處方中的山藥和五味子亦進(jìn)行了研究。其中對山藥的鑒別嘗試了環(huán)己烷－丙酮（10 ∶3）和乙酸乙酯 －甲醇 －濃氨試液（9 ∶1 ∶0.5）兩種展開系統(tǒng)，利用藥典提取方法進(jìn)行提取，最后均未得到相應(yīng)斑點(diǎn)，考慮到可能是處方中藥味多糖含量較高，可能影響了山藥有效成分的分離鑒別，故舍棄了該味藥材的鑒別。五味子利用藥典系統(tǒng)即在與對照品色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色斑點(diǎn)，但在后續(xù)試驗中發(fā)現(xiàn)，在與五味子甲素相近處有一明顯斑點(diǎn)，影響了薄層展開的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，需進(jìn)一步考察，故五味子薄層鑒別暫不列入文中。

在含量測定時，對供試品制備中的提取溶劑進(jìn)行了考察，分別采用30%乙醇、無水乙醇、30%甲醇、無水甲醇提取，結(jié)果表明采用30%乙醇提取效果好。直接采用溶劑稀釋法已能達(dá)到較高的葛根素提取率，簡便、經(jīng)濟(jì)，故未對樣品的提取方法進(jìn)行考察。

由樣品及粉葛藥材的含量測定結(jié)果可知，粉葛藥材中葛根素含量較低，剛剛符合符合2010年版《中國藥典（一部）》粉葛項下飲片相關(guān)規(guī)定（葛根素含量大于0.3%），這也導(dǎo)致了樣品中葛根素含量不高。因此，應(yīng)在生產(chǎn)中制訂內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，控制粉葛藥材中葛根素量，以保證樣品的療效。

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