同批黃芪藥材分類(lèi)提取研究

馬 哲,張 穎

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 杏林學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110167；2.遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局 技術(shù)審評(píng)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110003)

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同批黃芪藥材分類(lèi)提取研究

馬 哲1,張 穎2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 杏林學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110167；2.遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局 技術(shù)審評(píng)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110003)

目的：對(duì)同一批黃芪藥材中常見(jiàn)的三類(lèi)成分(多糖、皂苷、黃酮)進(jìn)行分離，避免因成分的重疊導(dǎo)致活性研究不確定的現(xiàn)象。方法：采用聚酰胺、AB-8型大孔樹(shù)脂等分離方法對(duì)黃芪中多糖、皂苷和黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行研究，并對(duì)提取物含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：對(duì)同一批黃芪藥材分離多糖、皂苷和黃酮類(lèi)物質(zhì)方案可行，且三類(lèi)提取物中成分不存在交叉現(xiàn)象。結(jié)論：今后對(duì)黃芪中不同成分活性的研究可采取同批分類(lèi)提取的方法。

黃芪；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；提取工藝；多糖；皂苷；黃酮

黃芪是中醫(yī)臨床常用的中藥，素有“補(bǔ)氣圣藥”之稱(chēng)，尤其在治療虛損病癥方面，是使用頻率較高的中藥之一。黃芪入藥歷史非常悠久，始見(jiàn)于漢墓馬王堆出土的帛書(shū)《五十二病方》中，藥學(xué)專(zhuān)著《神農(nóng)本草經(jīng)》亦將該藥列為上品。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[1]，黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌消炎、延緩衰老、改善血液和促進(jìn)造血等多種功效，尤其在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面，效果尤為顯著。

以往對(duì)于黃芪的提取工藝、含量測(cè)定及藥理活性研究大多只針對(duì)其中某一類(lèi)成分，而黃芪中含有多糖、黃酮、皂苷、氨基酸、微量元素等諸多化學(xué)成分。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，黃芪中的多糖類(lèi)成分具有抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、升高白細(xì)胞[4]的作用；黃酮具有增強(qiáng)免疫力[5,6]、抗炎[7]、抗突變[8]、抗骨質(zhì)疏松[9]的作用；皂苷具有抗病毒[10]、抗腫瘤[11]、抗血栓[12]、增強(qiáng)免疫力[13,14]的作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一批黃芪多糖、黃酮、皂苷類(lèi)成分的提取進(jìn)行工藝研究并對(duì)提取物含量進(jìn)行檢測(cè)[15-17]，為進(jìn)一步分析黃芪的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

生藥黃芪購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，安國(guó)市京興藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：080522；聚酰胺樹(shù)脂，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠，批號(hào)：20050429；AB-8型大孔樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司，批號(hào)：20050429；黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110781-200613)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080-200707)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；無(wú)水葡萄糖(批號(hào)：F20080601)、蒽酮(批號(hào)：F20080416)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、濃硫酸、甲醇、α-萘酚、氯仿、高氯酸、冰乙酸、香草醛等試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

1.2 主要儀器及設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，型號(hào)：HH-2；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-3000；瑞士XS225A型電子分析天平(萬(wàn)分之一)；日本島津UV-2450型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取分離

稱(chēng)取黃芪藥材1400g，加入10倍量70%乙醇提取3次，每次1h，得提取液A和藥渣A。藥渣A加8倍量水提取3次，每次1h，合并濾液后加入95 %乙醇至醇濃度達(dá)70%，沉淀經(jīng)減壓干燥后得提取物I(82.67g)。提取液A減壓回收乙醇后上60～80目聚酰胺樹(shù)脂柱，用水洗脫得洗脫液B，再用70%乙醇洗脫得洗脫液C。洗脫液C減壓回收乙醇后干燥得提取物II(64.08g)，洗脫液B上AB-8樹(shù)脂，用95%乙醇洗脫，溶液減壓回收乙醇，濃縮干燥后得提取物III(5.23g)。

2.2 定性鑒別

提取物I～I(xiàn)II分別經(jīng)α-萘酚試驗(yàn)、Salkowski反應(yīng)、鹽酸-鎂粉試驗(yàn)、用力振蕩等定性實(shí)驗(yàn)鑒別其中成分。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取物I～I(xiàn)II定性鑒別結(jié)果

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)。

經(jīng)定性分析實(shí)驗(yàn)可知，提取物I中主要為多糖類(lèi)物質(zhì)，提取物II中為黃酮類(lèi)物質(zhì)，提取物III中為皂苷類(lèi)物質(zhì)，初步判斷三類(lèi)成分之間不存在交叉現(xiàn)象。

2.3 總多糖含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取于105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，置于50mL的容量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，混勻，得到0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定50mg黃芪提取物I，用蒸餾水定容于50mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密吸取該溶液1、2、3、4、5mL置于10mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。分別吸取以上各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL于具塞試管中，加0.2%蒽酮-濃硫酸溶液4mL，振搖2min后，旋轉(zhuǎn)于沸水浴中加熱15min，取出置冷水中冷卻。以蒽酮-濃硫酸溶液為空白，于488nm處測(cè)吸光度。經(jīng)回歸得線性方程A=2.9757C+0.0131，R2=0.9994。在0.2～1mg/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系，如圖1所示。

圖1 黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取3mL葡萄糖對(duì)照品溶液6份，置于5mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。依法顯色后測(cè)定吸收度，RSD為2.20%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.3.5 樣品溶液穩(wěn)定性和顯色后溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份黃芪提取物I樣品溶液，分別在0、1、2、3、4h取樣1mL，依法顯色，以蒽酮-濃硫酸溶液為空白，在488nm處測(cè)定吸收度，RSD為2.19%，表明樣品溶液4h內(nèi)穩(wěn)定。取黃芪提取物I樣品溶液1mL，依法顯色后放置，分別在0、1、2、3h測(cè)定吸收度，RSD為1.51%，表明樣品溶液顯色后3h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批黃芪提取物I樣品進(jìn)行6次獨(dú)立測(cè)定吸收度，計(jì)算樣品中黃芪多糖含量。結(jié)果表明，黃芪多糖平均含量為35.30%，RSD為2.64%。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的黃芪提取物I粉末25mg，精密稱(chēng)定，精密加入適量葡萄糖對(duì)照品，加蒸餾水定量溶解于50mL量瓶中。取1mL加蒸餾水稀釋至5mL，得到供試品溶液。依法顯色，以蒽酮-濃硫酸溶液為空白，在488nm處測(cè)定吸收度。實(shí)驗(yàn)表明，平均回收率為93.88%，RSD為3.64%。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 取3批黃芪提取物I樣品50mg，精密稱(chēng)定，用蒸餾水定容于50mL容量瓶中，作為供試品溶液。照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備各項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收度。根據(jù)回歸方程，黃芪提取物I中總多糖的含量為36.19%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃芪提取物I中多糖含量

2.4 總黃酮含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取120℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，加無(wú)水甲醇溶解，定容至50mL容量瓶中，搖勻，得到0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定50mg黃芪提取物II，用無(wú)水甲醇定容于50mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于5mL容量瓶中，加無(wú)水甲醇至刻度，混勻。以無(wú)水甲醇為空白，于510nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算得回歸方程A=34.399C+ 0.0853，R2=0.9992。在20～100μg/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系，如圖2所示。

圖2 黃芪黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.6mL葡萄糖對(duì)照品溶液6份，置于5mL量瓶中，加無(wú)水甲醇至刻度，搖勻。依法顯色后測(cè)定吸收度，RSD為1.54%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份黃芪提取物II樣品溶液0.5mL，分別在0、1、2、3、4h測(cè)定吸收度，RSD為1.37%，表明樣品溶液4h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批黃芪提取物II進(jìn)行6次獨(dú)立測(cè)定吸收度，計(jì)算樣品中黃芪黃酮含量。結(jié)果表明，黃芪黃酮平均含量為67.69%，RSD為1.67%。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的黃芪提取物II粉末25mg，精密稱(chēng)定，精密加人適量蘆丁對(duì)照品，加蒸餾水定量溶解于50mL量瓶中。取0.5mL加蒸餾水稀釋至25mL，得到供試品溶液。依法顯色，以甲醇為空白，在510nm處測(cè)定吸收度。實(shí)驗(yàn)表明，平均回收率為100.90%，RSD為2.00%。

2.4.8 樣品含量測(cè)定 取3批黃芪提取物II 50mg，精密稱(chēng)定，用無(wú)水甲醇定容于50mL容量瓶中，取0.5mL加蒸餾水稀釋至25mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備各項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸收度。根據(jù)回歸方程，黃芪提取物II中總黃酮的含量為68.58%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃芪提取物II中黃酮含量

2.5 總皂苷含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品5mg，加無(wú)水甲醇溶解，定容至50mL容量瓶中，搖勻，得到0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定50mg黃芪提取物III，置于具塞三角燒瓶中，加入50mL無(wú)水甲醇超聲15min，取上清液，蒸干。加入無(wú)水甲醇定容于50mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、1.2、2.2、3.2、4.2mL，分別置于具塞試管中。真空揮去溶劑，精密加入新鮮配置的5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，70℃水浴中加熱15min，冷卻，精密加入冰醋酸5mL，搖勻。以香草醛-高氯酸-冰醋酸溶液為空白，于570nm處測(cè)定吸光度。測(cè)定結(jié)果，計(jì)算得回歸方程A=0.5959C+0.0991，R2=0.9995。在20～400μg的范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系，如圖3所示。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取2mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液6份，分別置于具塞試管中。真空揮去溶劑。依法顯色后測(cè)定吸收度，RSD為2.22%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份黃芪提取物III樣品溶液，分別在0、1、2、3、4h測(cè)定吸收度，RSD為2.86%，表明樣品溶液4h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批黃芪提取物III樣品進(jìn)行6次獨(dú)立測(cè)定吸收度，計(jì)算樣品中黃芪皂苷含量。結(jié)果表明，黃芪皂苷平均含量為49.99%，RSD為3.73%。

圖3 黃芪皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的黃芪提取物III粉末25mg，精密稱(chēng)定，精密加人適量黃芪甲苷對(duì)照品，加蒸餾水定量溶解于50mL量瓶中。取0.3mL置于具塞試管中，真空揮去溶劑。依法顯色，以香草醛-高氯酸-冰醋酸溶液為空白，于570nm處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)表明，平均回收率為104.27%，RSD為3.22%。

2.5.8 樣品含量測(cè)定 取3批黃芪提取物III樣品50mg，精密稱(chēng)定置于具塞三角燒瓶中，加入50mL無(wú)水甲醇超聲15min，取上清液，蒸干。加入無(wú)水甲醇定容于50mL容量瓶中，精密量取0.3mL置于具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備各項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸收度。根據(jù)回歸方程，求出黃芪提取物III中總皂苷的含量為375.9mg/g。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃芪提取物III中皂苷含量

3 討論

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一般指單味或中藥復(fù)方制劑中產(chǎn)生藥效的物質(zhì)，如無(wú)機(jī)元素、小分子化合物(黃酮、皂苷、生物堿)及生物大分子(多糖、多肽、蛋白質(zhì))等。中藥所含成分復(fù)雜，每味中藥的作用可能與其中數(shù)十種、甚至上百種成分的協(xié)同作用有關(guān)，單獨(dú)分離某一成分不一定能產(chǎn)生明顯的療效。因此，揭示中藥及中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成為當(dāng)今學(xué)術(shù)界矚目的焦點(diǎn)問(wèn)題，也是中藥為國(guó)際市場(chǎng)所接受，發(fā)揮中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)巨大優(yōu)勢(shì)至關(guān)重要的一步。

黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒生肌和利水退腫之功效。藥理學(xué)證明其具有增強(qiáng)免疫功能、增強(qiáng)細(xì)胞代謝，以及抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、保肝及調(diào)節(jié)血糖、血脂等作用，然而對(duì)于黃芪中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)依然眾說(shuō)紛紜。以往研究大多采用提取藥物中某一類(lèi)成分，并檢測(cè)活性的模式。本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一批黃芪中常見(jiàn)的三類(lèi)成分(多糖、皂苷、黃酮)進(jìn)行了分離，結(jié)果顯示各成分之間沒(méi)有交叉且含量穩(wěn)定，為進(jìn)一步研究活性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Investigation in Extraction Methods in the Same Batch of Astragalus

Ma Zhe1,Zhang Ying2*

(1. Xinglin College of Liaoning Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110167, China;2. Liaoning Food and Drug Administration Technical Evaluation Center, Shenyang 110003, China)

Objective:Separate three types of components in the same batch of Astragalus, including polysaccharides, saponins and flavonoids, in order to avoid uncertain activity because of overlapping constituents.Methods:Investigate the extraction methods of polysaccharides, saponins and flavonoids in Astragalus with Polyamide, macroporous resin (AB-8) etc., and determine the content of the extracts.Results:It is feasible to separate the three extracts in the same batch of Astragalus with none of each parts overlapping.Conclusion:The reaserch of activity of components in Astragalus may extract in the same batch of herbs.

Astragalus; Efficacy Material Basis; Extraction Process; Polysaccharides; Saponin; Flavonoids

2014-02-14

馬哲(1981-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)院講師，研究方向?yàn)橹兴幏絼┭芯俊?/p>

張穎(1980-)，女，遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評(píng)中心主管藥師，研究方向?yàn)镚SP認(rèn)證。

R284.2

A

1673-2197(2014)10-0034-03