藥用真菌炭球菌生藥學(xué)研究

常麗影,周 賢,李愛欣,王淑敏*，白俊武，于江波

(1．長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700)

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藥用真菌炭球菌生藥學(xué)研究

常麗影1,周 賢1,李愛欣1,王淑敏1*，白俊武2，于江波2

(1．長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700)

目的：對吉林省藥用真菌炭球菌進(jìn)行生藥學(xué)研究，為其藥用開發(fā)提供鑒別依據(jù)。方法：采集炭球菌子實體，通過性狀鑒別和孢子與菌絲顯微特征觀察，結(jié)合文獻(xiàn)資料鑒定種類。利用薄層色譜建立炭球菌專屬性薄層鑒別特征，利用高效液相色譜法測定其化學(xué)成分含量。結(jié)果： 經(jīng)性狀及顯微特征研究，確定為藥用真菌“炭球菌Daldiniaconcentrica(Bolt.∶Fr.) Ces. & dr Not.”。薄層鑒別研究發(fā)現(xiàn)具有多個專屬性的薄層色譜斑點，并含有麥角甾醇成分。高效液相色譜法測定其麥角甾醇含量為0.16%。結(jié)論：通過炭球菌性狀鑒別、光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下孢子和菌絲特征、薄層鑒別圖譜等，可綜合鑒別炭球菌的真?zhèn)?，為其鑒別提供了參考依據(jù)，麥角甾醇含量可作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

炭球菌；生藥學(xué)；藥用真菌

炭球菌Daldiniaconcentrica(Bolt.∶ Fr.) Ces. & dr Not.別名炭球、黑輪炭球菌、黑輪層炭殼。隸屬于炭角菌科Xylariaceae、炭球菌屬Daldinia。該菌會引起樹木木質(zhì)腐朽，導(dǎo)致楊、柳、樺、椴、胡桃、杜鵑等多種樹木和枯立木、倒木、木樁、木建筑用材木質(zhì)腐朽，形成白色腐朽。此菌還常生長在栽培木耳、香菇的段木上，視為“雜菌”。 中國科學(xué)院昆明植物研究所劉開吉等[1]研究發(fā)現(xiàn)，從炭球菌中提取得到的化合物“炭球菌素”具有預(yù)防和治療艾滋病的作用。河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅都強等[2]研究發(fā)現(xiàn)，炭球菌中分離的3種化合物具有較強的抗真菌作用。因此，了解炭球菌特征可為今后其藥用提供鑒別依據(jù)。

1 儀器與材料

XS-213型生物顯微鏡(石家莊顯微鏡艾迪科教設(shè)備有限公司)；XL 30 ESEM FEG Scanning Electron MicroscopeFEIcompany.。LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)，麥角甾醇對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號：MUST-11070601)，甲醇為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水(18.2ΩPa)，其它試劑均為分析純。炭球菌采于吉林省德惠市楊樹林帶中，由長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液制備

精密稱取麥角甾醇對照品2.50mg，置于5mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得(0.50mg/mL)。

2.2 供試品溶液制備

準(zhǔn)確稱取炭球菌樣品1.000 7g ，置干燥具塞試管中，加入5mL甲醇，精密稱定重量，超聲提取30min，放至室溫，稱重，補加甲醇至原重量，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.3 色譜條件[3-5]

漢邦ODS-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為甲醇，檢測波長282nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。理論塔板數(shù)以麥角甾醇峰計不得少于3 000。色譜見圖1、圖2。

圖1 麥角甾醇對照品HPLC

圖2 炭球菌樣品HPLC

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、14μL，注入液相色譜儀，測定吸收峰面積。以麥角甾醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為：Y=130 328X-37 700，r=1，麥角甾醇在0.219 6～1.537 2μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 樣品含量測定

分別精密吸取對照品和供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按色譜條件測定，即得。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒別[6]

子實體較小, 半球形或近球形，直徑1.5～5cm，高1～3.5cm，無柄或近無柄。表面初期土褐或紫褐色，后變褐黑至黑色。內(nèi)部暗褐色，纖維狀，有明顯的同心環(huán)帶。生于闊葉樹腐木或樹皮上，單生或成群生長在一起。見圖3。

圖3 子實體

3.2 顯微鑒別

孢子淡黃色至灰褐色，呈不等邊橢圓形、腎臟形或頭盔形，11～16(17.8)μm×6～9(10.2)μm。光學(xué)顯微鏡表面紋飾呈網(wǎng)紋，掃描電鏡照片顯示呈多角形網(wǎng)狀突起。孢絲較長，不分枝，壁厚，直徑25μm～30μm，淡黃色。見圖4、圖5。

圖4 菌絲及孢子(光學(xué)顯微鏡10×40)

圖5 孢子(掃描電鏡20 000×)

3.3 薄層鑒別[7]

取炭球菌1g，加二氯甲烷40mL，回流提取1h，濾過，濾液揮干，殘渣加二氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。另取麥角甾醇對照品2mg，加入2mL二氯甲烷溶解，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，置以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(7∶4∶0.3)為展開劑的展開缸內(nèi)飽和20min，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，有如圖6所示的專屬性熒光斑點。噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，并顯示如圖7所示的其它專屬性斑點。

圖6 炭球菌薄層色譜熒光

圖7 炭球菌薄層色譜

3.4 樣品中麥角甾醇含量

按“2.3”項下色譜條件測定，平行樣品的吸收峰面積分別為263 297 、239 622，計算樣品中麥角甾醇的平均含量為0.01%。

4 結(jié)論

通過炭球菌性狀鑒別、光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下孢子和菌絲特征、薄層鑒別圖譜等，可綜合鑒別炭球菌的真?zhèn)?，為其鑒別提供了參考依據(jù)。薄層鑒別研究表明，炭球菌含有麥角甾醇成分，經(jīng)高效液相色譜法測定，其含量為0.01%，可作為炭球菌質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。在炭球菌的應(yīng)用開發(fā)方面，可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)，篩選優(yōu)良的炭球菌菌株，通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)菌絲體和發(fā)酵液，從菌絲體或發(fā)酵液中分離抗真菌和抗艾滋病病毒的有效物質(zhì)，為開發(fā)新型農(nóng)藥和治療艾滋病藥提供原材料。

[1] 劉吉開，鄭永唐，秦向東，等.炭球菌素及其制備方法和應(yīng)用[P].中國專利：1238357，2006.

[2] 羅都強，唐宏亮，楊小龍，等.從子囊菌炭球菌中分離的活性成分L-696，44和CytochalasinD對植物病原真菌的活性[J].植物保護(hù)學(xué)報，2007,34(2)：113-122.

[3] 張方英，方保梅，張靜．靈芝制品中麥角甾醇的檢測方法[J]．江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1997(19)：22.

[4] 張麗,王瑜杰,丁安偉. HPLC法測定靈芝孢子油中麥角甾醇的含量[J].江蘇中醫(yī)藥，2009,41(6)：52-53.

[5] 谷學(xué)新，趙紅帥，鄒洪，等.高效液相色譜法測定功能性紅曲米粉中的麥角甾醇[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2006(1):78-79.

[6] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000：576.

[7] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Research Pharmacognostics on Medicinal FungiDaldiniaConcentrica

Chang Liying1,Zhou Xian1,Li Aixin1,Wang Shumin1*，Bai Junwu2，Yu Jiangbo2

(1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China；2.Jilin Aodong Yanbian pharmaceutical co.ltd , Jilin 133700, China)

Objective:Research pharmacognostics on medicinal fungiDaldiniaconcentricain JiLin province to provide a identifying basis for medicinal development.Methods:The sporophore of Daldinia concentrica was collected so that its species was identified by researching morphological and microscopic characteristics of spore and mycelium as well as literature. Use TLC to establishDaldiniaconcentricaspecific characteristics,determine chemical composition content by HPLC.Results:The collected Daldinia concentrica was identified as medicinal fungi Daldinia concentrica (Bolt. ∶ Fr.) Ces. & dr Not.through the study of characters and microscopic characteristics.Ergosterol and a plurality of specific TLC spots were found in TLC study .HPLC shows the content of ergosterol in Daldinia concentrica is 0.16%.Conclusion:Though the identification of characters,observing the characteristics of spore and mycelium by optical microscope and scanning electron microscope,and TLC atlas, reference can be provided for the identification ofDaldiniaconcentrica.The content of ergosterol can be selected as a quality control component in Daldinia concentrica.

DaldiniaConcentrica；Pharmacognostics

2014-05-07

常麗影(1967-)，女，長春中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向為中藥炮制學(xué)。

王淑敏(1965-)，女，博士，長春中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥分析。E-mail: minshuw@sina.com.cn。

R93

A

1673-2197(2014)17-0021-03