4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化活性的季節(jié)變化

潘佳佳，葉生月，丁東棟，金政，楊萍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300；3.桐廬縣林業(yè)技術(shù)推廣中心站，浙江桐廬 311500）

4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化活性的季節(jié)變化

潘佳佳1，2，葉生月3，丁東棟1，金政1，楊萍2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300；3.桐廬縣林業(yè)技術(shù)推廣中心站，浙江桐廬 311500）

以毛竹Phyllostachys edulis，雷竹Phyllostachys violascens，石竹Phyllostachys nuda和高節(jié)竹Phyllostachys prominens等4種竹子為研究對(duì)象，用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采用DPPH·（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）法和ABTS+·[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]法測(cè)定竹葉黃酮的抗氧化活性，以考察竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗氧化活性隨季節(jié)和竹種的變化規(guī)律。結(jié)果表明：春季毛竹的竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（2.12%± 0.15%）（P＜0.05），夏季、秋季和冬季4種竹子間無顯著性差異（P＞0.05）；石竹的竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)四季變化不顯著（P＞0.05），毛竹夏季的竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.36%±0.60%）高于冬季（1.52%±0.04%）（P＜0.05），雷竹（2.40% ±0.17%）和高節(jié)竹（2.07%±0.13%）的竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以夏季最高。4種竹子的竹葉黃酮對(duì)DPPH·的清除能力都表現(xiàn)在夏季較強(qiáng)，四季的各竹種竹葉黃酮對(duì)DPPH·的清除能力以毛竹較強(qiáng)。4種竹子的竹葉黃酮對(duì)ABTS+·的清除能力都表現(xiàn)在春季和秋季較強(qiáng)，四季各竹種間差異性不大（P＞0.05）。圖6參12

植物生理學(xué)；竹葉黃酮；DPPH·清除能力；ABTS+·清除能力；抗氧化活性；四季變化

竹子為禾本科Poaceae竹亞科Bambusoideae多年生常綠植物，在中國(guó)分布很廣，資源十分豐富[1-2]。竹子在建筑、水利、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，然而，竹子加工利用后，竹葉卻總是被棄置，造成了極大浪費(fèi)[2]。竹葉中含有多種活性物質(zhì)，其主要活性物質(zhì)是黃酮類物質(zhì)，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，其清除DPPH·（2，2-二苯基-2-苦味基肼）的能力比茶多酚強(qiáng)[3]，并且對(duì)超氧負(fù)離子及羥基自由基均表現(xiàn)出較好的清除效果[2，4]，是一類極具開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑。郝培應(yīng)等[5]對(duì)6個(gè)竹種竹葉黃酮抗氧化性的研究表明：竹葉中黃酮的高低及其抗氧化性能的強(qiáng)弱與竹種有關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)：竹葉中黃酮更與季節(jié)相關(guān)[6-8]。然而，有關(guān)竹葉黃酮及其抗氧化性隨竹種、季節(jié)等因素變化的相關(guān)報(bào)道并不多見。本課題組以毛竹Phyllostachys edulis，雷竹Phyllostachys violascens，石竹Phyllostachys nuda和高節(jié)竹Phyllostachys prominens等4種竹子為對(duì)象[9]，研究竹葉中黃酮類物質(zhì)及其抗氧化活性隨竹種、季節(jié)的變化規(guī)律，為高效地利用竹葉資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地自然概況

毛竹、雷竹、石竹和高節(jié)竹等的竹葉采自浙江省桐廬縣。桐廬縣位于浙江省西北部，地處錢塘江水系中游，29°35＇～30°05＇N，119°11＇～119°58＇E，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫為16.6℃，極端最低溫-9.5℃，極端高溫41.7℃，穩(wěn)定通過10.0℃的持續(xù)時(shí)間為239 d，全年≥10.0℃的積溫為5 262.0℃，無霜期為252 d，年降水量為1 462 mm。桐廬縣屬于浙西低山丘陵區(qū)，全縣海拔500 m以下的丘陵平原占多數(shù)，500～1 000 m次之，1 000 m以上的中山最少。該縣有紅壤、黃壤、巖性土、潮土和水稻土等5個(gè)土類；上半年雨熱同步，下半年光照充足，有利于林木生長(zhǎng)。桐廬縣的竹類資源非常豐富，竹產(chǎn)業(yè)是桐廬縣的支柱產(chǎn)業(yè)之一，已初步形成毛竹、高節(jié)竹、雷竹、石竹四大竹產(chǎn)業(yè)區(qū)。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

采集植株為2年生竹子，分別選取竹冠上、中、下部以及陽面和陰面已完成展葉且健康的葉片，新舊葉混合采集，然后將采集的葉片均勻混合。采集的時(shí)間為2011年4月15日（春季）、2011年7月15日（夏季）、2011年10月15日（秋季）和2012年1月15日（冬季）的上午。標(biāo)準(zhǔn)樣品：蘆丁，純度均大于98%，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚等為分析純，水為超純水；DPPH試劑、ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]試劑購(gòu)自上海生工。儀器：InfiniteM200多功能酶標(biāo)儀，日立CF16RX高速冷凍離心機(jī)，R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DGG-9053AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，回流裝置，微波爐，粉碎機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 竹葉黃酮的提取將采集的竹葉洗凈、瀝干并立即用微波爐殺青（700W，加熱3次，1min·次-1），葉樣置于烘箱（60℃）中干燥，粉碎過40目篩，置于冰箱里密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分別稱取竹葉粉末各5.00 g，加入50.00mL體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇在75℃下回流提取4 h，立即抽濾并收集濾液，用同樣的方法處理濾渣，回流提取2 h后抽濾并合并2次的濾液得黃酮粗提液，用石油醚萃取（3次），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后的殘?jiān)S酮粗提物）稱量，用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇溶解定容至25.00mL容量瓶中，置于4℃冰箱保存。

1.3.2 竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[1]的研究方法，得回歸方程為y=0.010 3x+0.015 4，r=0.996 8，線性范圍為0～600μg。樣品測(cè)定：將黃酮濃縮液離心（3 500 r·min-1，4℃，10min），精密量上清液100μL，稀釋10倍后，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法處理，以零管為空白，搖勻后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值D（λ），重復(fù)做3組·樣-1。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（g·g-1）。

1.3.3 竹葉黃酮抗氧化測(cè)定DPPH·清除試驗(yàn)：0.101 mmol·L-1DPPH·溶液的配置參照文獻(xiàn)[1]的方法。將樣品用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇配制成一系列濃度，取3.90 mL 0.101 mmol·L-1DPPH·和0.10 m L待測(cè)樣溶液混合搖勻，在室溫下反應(yīng)1 h后在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值D（λ）。以3.90 mL 0.101 mmol·L-1DPPH·和0.10mL體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度值D（λ）0，計(jì)算各樣品抑制率，平行操作3次·樣-1。抑制率（%）=[D（λ）0-D（λ）1]D（λ）0-1×100。ABTS+·[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]清除試驗(yàn)：ABST·儲(chǔ)備液的配置參照文獻(xiàn)[10]的方法。將樣品用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇配制成一系列濃度，取0.15 mL待測(cè)樣溶液與2.85 mL ABTS+·工作液混合搖勻，室溫下反應(yīng)10min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值D（λ）。以2.85 mL ABTS+·工作液和0.15mL體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇為空白對(duì)照，測(cè)得吸光值D（λ）0，計(jì)算各樣品抑制率，平行操作3次·樣-1。抑制率（%）=﹛[D（λ）0-D（λ）1]/D（λ）0﹜×100。

1.3.4 半抑制濃度（CIC50）的計(jì)算以待測(cè)液樣品濃度為橫坐標(biāo)（x），抑制率為縱坐標(biāo)（y）得出待測(cè)樣品濃度與清除DPPH·和ABTS+·能力的線性關(guān)系。計(jì)算得到待測(cè)樣品的CIC50。半抑制濃度越小，表示樣品的抗氧化性越強(qiáng)，反之，則表示樣品的抗氧化性越弱。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，結(jié)果采用“SPSS 16.0”統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

2.1.1 同一季節(jié)4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較如圖1所示：夏季、秋季和冬季4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性差異（P＞0.05）。春季4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在較大差異，毛竹的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.12%±0.15%）明顯高于其他竹種，石竹次之，高節(jié)竹的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1.54%±0.05%）最低，雷竹的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與高節(jié)竹和石竹差異不顯著（P＞0.05）。

2.1.2 同一竹種不同季節(jié)竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較如圖2所示：石竹竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)四季都無顯著性差異（P＞0.05）。毛竹夏季竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.36%±0.6%）高于冬季（1.52%±0.04%），且差異顯著（P＜0.05），其他季節(jié)間無顯著性差異（P＞0.05）。雷竹黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.4%±0.17%）和高節(jié)竹黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.07%±0.13%）均在夏季最高，與其他季節(jié)相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)季節(jié)變化對(duì)石竹葉中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有影響。

圖1 同一季節(jié)4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（n=3）Figure 1 Comparison of flavonoids，content for four kinds of bamboo leaves in the same season（n=3）

圖2 同一竹種四季竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（n=3）Figure 2 Comparison of flavonoids，content in four seasons ofevery bamboo（n=3）

2.2 抗氧化活性比較

2.2.1 同一季節(jié)4種竹子竹葉黃酮的抗氧化能力比較如圖3所示：4種竹子竹種對(duì)DPPH·的清除能力為：春季毛竹＞石竹、高節(jié)竹＞雷竹；夏季毛竹＞雷竹＞高節(jié)竹＞石竹；秋季4種竹子竹種間差異不顯著（P＞0.05）；冬季雷竹＞石竹，其他竹種間無顯著性差異（P＞0.05）。如圖4所示：4種竹子竹種對(duì)ABTS+·的清除能力：在春季，毛竹與石竹的清除能力具有顯著性差異（P＜0.05），其他各竹種間差異不顯著（P＞0.05）；夏、秋、冬季節(jié)4種竹子竹種葉黃酮對(duì)ABTS+·的清除能力均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 同一季節(jié)4種竹子竹葉黃酮對(duì)DPPH·的清除能力（n=3）Figure 3 Ability of flavonoids to scavenge DPPH·in fourbamboo leaves in same season（n=3）

圖4 同一季節(jié)4種竹子竹葉黃酮對(duì)ABTS+·的清除能力（n=3）Figure 4 Ability of flavonoids to scavenge ABTS+·in four bamboo leaves in same season（n=3）

2.2.2 同一竹種各季節(jié)竹葉黃酮的抗氧化能力比較如圖5所示：同一竹種不同季節(jié)的竹葉黃酮對(duì)DPPH·的清除作用存在不同程度的差異，毛竹的竹葉黃酮抗氧化能力為夏季＞春季、冬季＞秋季；雷竹的為夏季＞冬季＞秋季＞春季；高節(jié)竹的為夏季＞秋季、冬季＞春季；石竹的為夏季、秋季、冬季＞春季。如圖6所示：4種竹子的竹葉黃酮對(duì)ABTS+·的清除作用在四季的變化趨勢(shì)基本相同，春季與秋季抗氧化活性較強(qiáng)，夏季與冬季較弱。同一竹種四季抗氧化能力，毛竹：春季、秋季＞夏季、冬季；雷竹：春季、秋季＞夏季、冬季；高節(jié)竹：春季、秋季＞冬季＞夏季；石竹：春季、秋季＞夏季、冬季。

圖5 同一竹種四季竹葉黃酮對(duì)DPPH·的清除能力（n=3）Figure 5 Ability of flavonoids in every bamboo leaves to scavenge DPPH·in four seasons（n=3）

圖6 同一竹種四季竹葉黃酮對(duì)ABTS+·的清除能力（n=3）Figure 6 Ability of flavonoids in every bamboo leaves to scavenge ABTS+·in four seasons（n=3）

3 結(jié)論與討論

竹葉中含有多種具有抗氧化、抗病毒和抗癌等功效的活性物質(zhì)[11]，其中竹葉黃酮為一種天然活性物質(zhì)，在體外具有很強(qiáng)的還原力，可以有效清除DPPH·和ABTS+·。竹葉黃酮相關(guān)信息的收集與積累是竹子資源綜合利用的前提，本研究結(jié)果可為今后竹類植物的選種、育種及適宜竹葉采集時(shí)間的確定奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：毛竹、雷竹和高節(jié)竹竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在夏季較高，在呂兆林等[8]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律。因此，夏季是開發(fā)利用毛竹等3種竹子竹葉資源較好的季節(jié)，其中毛竹竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨季節(jié)的變化與福建省毛竹相比，雖黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在夏季最高，但其他季節(jié)的變化規(guī)律存在差異[8]；南京箬竹Indocalamus latifolius葉的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)則是在春冬季節(jié)較高[7]。由此可見：不同地區(qū)、不同竹種以及季節(jié)的變化均會(huì)造成竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同程度的差異。

本研究中選用了DPPH·和ABTS+·等2種指標(biāo)測(cè)定竹葉黃酮的抗氧化活性，4種竹子竹種的竹葉黃酮在四季都表現(xiàn)出了不同程度的抗氧化作用，其中春季毛竹比其他季節(jié)竹種略強(qiáng)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)對(duì)這4個(gè)竹種而言，其都在夏季表現(xiàn)出對(duì)DPPH·的高清除率，在春季和秋季表現(xiàn)出對(duì)ABTS+·的高清除率，這可能是由于不同季節(jié)竹種竹葉黃酮因其組成、結(jié)構(gòu)的差異，造成其與DPPH·，ABTS+·反應(yīng)速率不同，反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間不同，因此，將反應(yīng)時(shí)間固定在某一值時(shí)，就可能使抗氧化性的結(jié)果出現(xiàn)差異[12]。將竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化性進(jìn)行相關(guān)性比較，發(fā)現(xiàn)有些竹種同時(shí)具有最高的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和最好的抗氧化性，比如在春季，毛竹的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，抗氧化能力也最強(qiáng)，有些竹種的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化性之間卻沒有明顯的相關(guān)性，比如在夏季，高節(jié)竹的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與毛竹無顯著性差異，但其抗氧化活性弱于毛竹。可見在考察竹葉黃酮的抗氧化性能上，除了測(cè)定黃酮類物質(zhì)外，還要進(jìn)一步考慮到該類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其生理活性之間的關(guān)系[5]。

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Seasonal flavonoid and anti-oxidant changes in leaves of four bamboo species

PAN Jiajia1，2，YE Shengyue3，DINGDongdong1，JIN Zheng1，YANG Ping2
（1.School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&F University，Lin，an 311300，Zhejiang，China；2.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin，an 311300，Zhejiang，China；3.Forest Technology Extension Central Station of Tonglu County，Tonglu 311500，Zhejiang，China）

Leaves of four bamboo species：Phyllostachys edulis，Phyllostachys violascens，Phyllostachys nuda，andPhyllostachys prominenswere studied to determine variation in flavonoid content and anti-oxidant activity for different seasons.Aluminum nitrate-sodium nitrite colorimetry was used to find the flavonoid content with 2，2 diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH·）and 2，2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid（ABTS+·）being employed to discover anti-oxidative activity.Results in spring showed that flavonoid content of Ph.edulis was highest（2.12%±0.15%）（P＜0.05），but in summer，autumn，and winter，therewere no significant differences among the four bamboo species（P＞0.05）in the test flavonoid content.Flavonoid content of Ph.nuda did not change significantly（P＞0.05）during the four seasons；for Ph.edulis，summer flavonoid content（2.36%± 0.6%）was higher than winter（1.52%±0.04%）（P＜0.05）；and forPh.violascens（2.40%±0.17%）and Ph.prominens（2.07%±0.13%）the highest flavonoid contentwas in summer.The scavenging ability of DPPH·for bamboo leaf flavonoidswas higher in summer with Ph.edulis being best.The scavenging ability of ABTS+·forbamboo leaf flavonoids was greater in spring and autumn with no significance（P＞0.05）between species. These results can be used for the exploitation of bamboo resources.[Ch，6 fig.12 ref.]

plant physiology；flavonoids；DPPH·；ABTS+·；anti-oxidantactivities；seasonal change

S795；S718.3

A

2095-0756（2014）02-0280-05

2013-04-24；

2013-10-23

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20101032B58）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210341006）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）項(xiàng)目（2012R412006）

潘佳佳，從事林學(xué)研究。E-mail：1192842935@qq.com。通信作者：楊萍，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事林木生物技術(shù)研究。E-mail：568985671@qq.com