中草藥紅茶菌的制備及其體內(nèi)抗口蹄疫病毒活性

符乃方，吳俊才，符啟俊，呂 律，何繼軍，李開綿，葉劍秋，蔣盛軍* ，蔣小強(qiáng)，邱紅輝，高李澤，何萍，謝崢嶸，陳吉雄

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院，熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571737;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046;3.海南東方市畜牧局動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，海南東方 570100)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)引起的偶蹄類動(dòng)物疾病?？谔阋呤怯绊懶竽翗I(yè)發(fā)展的最重要的動(dòng)物傳染病，在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類傳染病中的頭號(hào)傳染病，在我國(guó)，該病也列為一類動(dòng)物疫病?？谔阋叩谋l(fā)會(huì)給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)造成嚴(yán)重的損失。2001年英國(guó)爆發(fā)口蹄疫疫情，撲殺700萬(wàn)頭牲畜，造成85億英鎊的損失，同時(shí)，該疫情還波及法國(guó)、荷蘭、愛爾蘭等國(guó)，這些國(guó)家共撲殺多達(dá)36萬(wàn)頭牲畜［1］。在發(fā)展中國(guó)家，注射口蹄疫疫苗是預(yù)防口蹄疫最有效的措施之一。但由于口蹄疫病毒是RNA病毒，病毒的基因和病毒的抗原特性改變很快，因此，這顯著增加了研制高效的口蹄疫疫苗的難度。雖然發(fā)達(dá)國(guó)家采用動(dòng)物撲殺可以有效預(yù)防口蹄疫，但一旦爆發(fā)口蹄疫，大量沒有免疫的動(dòng)物面臨更大的感染風(fēng)險(xiǎn)［2］。因此，口蹄疫的防控依然是畜牧業(yè)中動(dòng)物疫控研究最重要的研究課題之一。采用有效的衛(wèi)生措施也是預(yù)防口蹄疫的技術(shù)措施之一。

口蹄疫病毒是一種對(duì)酸高度敏感的病毒。這是因?yàn)榭谔阋卟《驹谒嵝詶l件下脫下蛋白衣殼進(jìn)行繁殖;如果它還沒有侵染進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞，提前脫下蛋白衣殼將會(huì)影響病毒的繁殖而導(dǎo)致病毒的死亡［3-4］。中草藥紅茶菌是一種利用紅茶菌發(fā)酵茶葉、羅漢果、甘草、野菊花等中草藥提取液的新型紅茶菌菌液。由于它保留了紅茶菌的產(chǎn)酸特性，因此中草藥紅茶菌制劑可以體外有效殺滅口蹄疫病毒。茶葉、羅漢果、甘草、野菊花是一些具有藥食兩用的中草藥植物，這些植物的提取液普遍具有提高動(dòng)物免疫力、拮抗病原細(xì)菌、病毒等方面的作用。為了進(jìn)一步挖掘中草藥紅茶菌抑制口蹄疫病毒潛力，筆者在此介紹了這種中草藥紅茶菌的制備、中草藥紅茶菌體內(nèi)抗口蹄疫病毒活性的試驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中草藥紅茶菌的制備。所用紅茶菌菌種購(gòu)自北京食品研究所。紅茶菌母液的制備參考呂愛軍等提供的方法［5］。制備中藥提取液是將0.2%茶葉、0.5%甘草、0.2%羅漢果和0.2%野菊花放入水溶液中煮沸，過濾后冷卻到約30℃以下時(shí)加入20%紅茶菌母液，靜置發(fā)酵2周后用于檢測(cè)或臨床使用。

1.1.2 口蹄疫病毒。豬O型O/China/99株，系豬源O型口蹄疫乳鼠組織毒。該毒株對(duì)乳鼠半數(shù)致死量(LD50)為10-8.0，對(duì)豬半數(shù)感染量(SID50)為10-6.0，攻毒時(shí)用0.04 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.6)稀釋成1 000 SID50病毒懸液，即 1∶1 000 倍稀釋。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物。2月齡左右健康試驗(yàn)豬，口蹄疫O型液相阻斷ELISA檢測(cè)口蹄疫O型抗體效價(jià)小于1∶4，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體陰性。試驗(yàn)用豬購(gòu)自甘肅省莊浪縣某小型養(yǎng)豬場(chǎng)。

1.1.4 檢測(cè)試劑。O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒(LPB-ELISA)、口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELISA試劑盒(FMDV NSP 3ABC-I-ELISA Kit)，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供?？谔阋卟《緦?shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒由國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥。隨機(jī)選取陰性健康豬20頭，隨機(jī)分為4組，分別為H組(高劑量組)、M組(中劑量組)、L組(低劑量組)和C組(健康對(duì)照組)，每組5頭。試驗(yàn)組H組、M組、L組及C組給藥時(shí)間、劑量、途徑等按照表1操作。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥量及時(shí)間

1.2.2 病毒復(fù)制水平檢測(cè)。在給藥第3天以及攻毒后第1、第3、第5、第7天采集抗凝血，應(yīng)用real-time RT-PCR方法測(cè)定口蹄疫病毒復(fù)制copy數(shù)。

1.2.3 口蹄疫病毒抗體水平檢測(cè)。給藥第3天及攻毒后第3、第10天，用口蹄疫O型液相阻斷ELISA方法檢測(cè)豬體內(nèi)O型口蹄疫病毒抗體水平。

1.2.4 攻毒試驗(yàn)。給藥3 d后，進(jìn)行O型口蹄疫毒株(豬O型O/China/99株鼠毒)攻毒試驗(yàn)。攻毒濃度為1 000 SID50，劑量為3 ml/頭，耳后肌肉注射。對(duì)照組和試驗(yàn)組均攻毒。攻毒后連續(xù)觀察10 d。攻毒期間各組按照不同給藥比例繼續(xù)給藥。

1.2.5 體溫測(cè)定。給藥和攻毒期間，每天測(cè)定、記錄直腸體溫。攻毒后，體溫僅為參考值，不做統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)試樣品安全性評(píng)價(jià) 攻毒試驗(yàn)前，連續(xù)給藥3 d，試驗(yàn)豬均未見明顯的臨床副反應(yīng)，精神狀態(tài)、采食等情況基本正常。表2顯示，第1天有3頭豬體溫高于39.5℃，第2天有1頭豬體溫高于39.5℃，第3天有7頭豬體溫高于39.5℃，可見試驗(yàn)豬體溫基本在正常范圍。

表2 試驗(yàn)豬攻毒前給藥期間體溫記錄

2.2 攻毒試驗(yàn)結(jié)果 給藥3 d后，進(jìn)行O型口蹄疫攻毒試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)照組全部發(fā)病(其中1只第3天發(fā)病，后表現(xiàn)為拉稀、體弱，于第6天死亡)。從H組、M組、L組攻毒結(jié)果(表3)可以看出，低劑量給藥豬3/5保護(hù)，中劑量給藥豬1/5保護(hù)，高劑量給藥豬0/5保護(hù);在低劑量給藥條件下，攻毒保護(hù)效果優(yōu)于中劑量和高劑量;攻毒后發(fā)病豬臨床癥狀與對(duì)照組相似，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不明顯。

表3 攻毒試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

續(xù)表3

2.3 病毒復(fù)制水平 熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)給藥第3天采集的全血(本底樣品)，未檢測(cè)到口蹄疫病毒copy數(shù)。試驗(yàn)對(duì)照成立。從攻毒后的第1天到第7天，陸續(xù)從試驗(yàn)豬全血中檢測(cè)到口蹄疫病毒，M組復(fù)制水平最高，L組復(fù)制水平最低(表4)。

表4 不同試驗(yàn)組病毒copy數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.4 口蹄疫病毒抗體水平檢測(cè) 給藥第3天及攻毒后第3、第10天，用口蹄疫O型液相阻斷ELISA方法檢測(cè)豬體內(nèi)O型口蹄疫病毒抗體水平。結(jié)果(表5)顯示，第3天僅有H組1頭豬O型抗體≥1∶64，其他試驗(yàn)豬抗體水平均低于1∶64;第10天時(shí)，H組和M組試驗(yàn)豬口蹄疫抗體水平均≥1∶64;L組和C組各有1頭豬抗體水平均低于1∶64。可見，給藥組與對(duì)照組在攻毒后10 d，口蹄疫病毒抗體水平無(wú)差別。根據(jù)中草藥紅茶菌體內(nèi)抗口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果，可以得出中低濃度的中草藥紅茶菌在體內(nèi)對(duì)口蹄疫病毒具有一定的抑制作用。

3 討論

一種理想的口蹄疫防控試劑應(yīng)該具有在體外和體內(nèi)均能殺滅或抑制口蹄疫病毒，且這種殺滅或抑制又是廣譜性的;同時(shí)，這種制劑必須無(wú)毒副作用，可以經(jīng)常性來(lái)使用;最好，這種制劑必須物美價(jià)廉，才能大量推廣使用。如果使用這樣的口蹄疫防控試劑，對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境噴霧消毒，可以殺滅動(dòng)物周圍環(huán)境的病毒;如果對(duì)動(dòng)物進(jìn)行口服和鼻噴，讓這樣的制劑進(jìn)入動(dòng)物消化道和呼吸道，殺滅動(dòng)物呼吸道和消化道內(nèi)的口蹄疫病毒;口服進(jìn)入體內(nèi)后，這種制劑又能殺滅或抑制體內(nèi)的口蹄疫病毒。因此，使用這樣的制劑就可以構(gòu)建一個(gè)立體的、多層次的口蹄疫防控體系，從而起到有效防控口蹄疫的發(fā)生。即使局部發(fā)生，這種制劑也可以達(dá)到快速使用來(lái)預(yù)防口蹄疫的目標(biāo)。由于滿足理想口蹄疫防控制劑的標(biāo)準(zhǔn)難度大，目前尚無(wú)這樣的制劑出現(xiàn)，僅有一些具備某方面的口蹄疫防控制劑，如口蹄疫疫苗、口蹄疫消毒劑、RNA干擾劑等，所以利用上述制劑都難以構(gòu)建一個(gè)完善的口蹄疫防控體系。

表5 不同試驗(yàn)組口蹄疫病毒O型抗體測(cè)定結(jié)果

紅茶菌是一個(gè)以醋酸菌、酵母菌為主的復(fù)合共生菌群。醋酸菌是自然界產(chǎn)酸性最強(qiáng)的產(chǎn)酸菌之一，因此，醋酸菌和酵母菌所形成的復(fù)合共生菌群是產(chǎn)生最強(qiáng)的復(fù)合產(chǎn)酸菌群之一。相對(duì)于其他產(chǎn)酸的益生菌如單一的乳酸菌、酵母菌，紅茶菌通過產(chǎn)生大量有機(jī)酸可以有效抑制口蹄疫病毒在體外以及動(dòng)物消化道或呼吸道的繁殖。在紅茶菌基礎(chǔ)上研制的中草藥紅茶菌，含有大量廣譜性抗病毒的中草藥如甘草、菊花、茶葉等提取液成分，因此，動(dòng)物口服中草藥紅茶菌后，在體內(nèi)也可以有效抑制口蹄疫病毒在體內(nèi)的繁殖。這種機(jī)制有可能是如其中的甘草提取液中的甘草多糖可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生干擾素來(lái)提高動(dòng)物機(jī)體的抗病毒特性［6-7］。由于中草藥紅茶菌是利用紅茶菌發(fā)酵常見的中草藥提取液而成，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，本身無(wú)毒副作用，因此，可以廣泛用于對(duì)口蹄疫的防控。由于中草藥紅茶菌對(duì)口蹄疫病毒在體外和體內(nèi)均有良好的抑制作用，因此，對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)地噴霧消毒、對(duì)偶蹄類動(dòng)物口服(口噴)和鼻噴就可以形成有效預(yù)防口蹄疫的三道防線，從而能夠有效預(yù)防口蹄疫。中草藥紅茶菌預(yù)防口蹄疫的機(jī)理如圖1所示。該研究表明，使用一次中草藥紅茶菌，在1周之內(nèi)，從豬的糞便中分離出大量醋酸菌，表明紅茶菌中的醋酸菌和酵母復(fù)合共生菌群在豬的消化道中能存活長(zhǎng)達(dá)1周或更長(zhǎng)的時(shí)間。因此，每周對(duì)動(dòng)物噴霧1次左右，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)口蹄疫的長(zhǎng)效預(yù)防。其次，對(duì)動(dòng)物噴霧中草藥紅茶菌，還可以預(yù)防其他細(xì)菌性和病毒性疾病，因此，噴霧中草藥紅茶菌還可以帶有其他額外的預(yù)防效益。當(dāng)前，我國(guó)的口蹄疫無(wú)疫區(qū)建設(shè)正逐漸與國(guó)際接軌，逐漸從口蹄疫疫苗注射防控下的無(wú)疫區(qū)轉(zhuǎn)向非免疫的無(wú)疫區(qū)。但我國(guó)的動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模大小不一、氣候和環(huán)境多樣性大，口蹄疫疫情復(fù)雜，因此，如何實(shí)現(xiàn)口蹄疫疫苗注射防控下的無(wú)疫區(qū)平穩(wěn)轉(zhuǎn)變?yōu)榉敲庖叩臒o(wú)疫區(qū)，困難和挑戰(zhàn)很多。中草藥紅茶制劑作為一種無(wú)毒、高效、低成本的非免疫的口蹄疫防控制劑和防控技術(shù)將會(huì)在我國(guó)未來(lái)的口蹄疫無(wú)疫區(qū)建設(shè)中發(fā)揮重要作用。

圖1 噴霧中草藥紅茶菌預(yù)防口蹄疫的作用路線

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