葡萄皮DNA檢驗

王鳳寬 杜 舟 王傳海 李湘秦 吳 勇

（深圳市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣東 深圳 518040）

葡萄皮DNA檢驗

王鳳寬 杜 舟 王傳海 李湘秦 吳 勇

（深圳市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣東 深圳 518040）

葡萄皮作為較少見生物物證的一種，在犯罪現(xiàn)場時有發(fā)現(xiàn)并提取，由于葡萄皮上附有的人口腔脫落細胞DNA含量較低并存在多種PCR擴增抑制因素，熒光STR檢測成功率較低。對在入室盜竊案現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的葡萄皮用骨骼裂解液裂解提取，并用QIAquickRPCR Purification Kit硅膠膜過柱法富集純化DNA，獲得理想STR分型結(jié)果并通過DNA數(shù)據(jù)庫比中嫌疑人，從而通過對葡萄皮DNA的成功檢驗在案件偵破、訴訟中發(fā)揮重要作用。

葡萄皮 STR QIAquickRPCR Purification Kit硅膠膜過柱法

1 案例資料

1.1 簡要案情

2012年9月26日，居住在深圳市光明新區(qū)光明街道辦事處新陂頭村籃球場旁出租屋的廣西人覃××報案稱，當(dāng)日18時30分許下班回到住處發(fā)現(xiàn)被盜，現(xiàn)場勘查了解覃××家中冰箱內(nèi)的一串葡萄不見了，室內(nèi)地上有散在的懷疑為嫌疑人吃葡萄后丟棄的紫色葡萄皮，技術(shù)人員收集提取葡萄皮送檢。

1.2 DNA提取及檢驗

取干凈剪刀、鑷子，將完整一個吃剩的葡萄皮剪碎，裝入1.5ml Eppendorf管，加入260ul骨骼裂解液（Bone Incubation Buffer，美國Promega公司），30ul 20mg/ml蛋白酶K，10ul 1M DTT，震蕩10sec充分混勻，56℃消化1h，期間震蕩1-2次，每次10sec。瞬時離心，取 3ul用 AmpFLSTRRIdentifilerRPlus試劑盒（AB公司，美國）直接擴增，余消化液和載體通過吊籃式離心去除載體轉(zhuǎn)移收集消化液至新的1.5ml Eppendorf管中備用。

用德國QIAGEN公司QIAquickRPCR Purification Kit純化試劑盒進行純化濃縮。

加入5倍體積的Buffer PB（Binding buffer） 至含消化液的1.5mlEppendorf管中，震蕩混勻；取一個新的帶有2ml收集管（2ml collection tube）的純化柱（QIAquickRSpin Column），吸取700ul混合液至純化柱，8000rmp離心1min，丟棄已濾過的液體（管不換）；重復(fù)此操作直到混合液全部濾過；吸取700ul已配無水乙醇的Buffer PE（Wash buffer）至純化柱，13000rmp、1min離心洗滌1次，丟棄收集管中已濾過的液體；吸取80%乙醇700ul至純化柱，13000rmp、1min離心洗滌1次，丟棄收集管中已濾過的液體；再以13000rmp離心3min，甩干殘余液體后把純化柱放置于新的1.5ml Eppendorf管上，打開純化柱蓋子室溫揮發(fā)2min；將已在65℃預(yù)熱的Buffer EB（Elution buffer） 30ul直接加入到純化柱的硅膠膜，65℃孵育2min，13000rmp離心2min，收集于1.5ml Eppendorf管，取3ul用AmpFLSTRRIdentifilerRPlus試劑盒擴增（AB公司，美國），3130xl型遺傳分析儀（AB公司，美國）電泳，GeneMapperID V3.2分析判型。

1.3 數(shù)據(jù)庫比對和結(jié)果判定未純化濃縮前的樣品直接擴增未檢出STR分型。用QIAquickRPCR Purification Kit純化試劑盒純化濃縮后樣品檢出STR分型。

分型結(jié)果錄入全國DNA數(shù)據(jù)庫后與2011年12月9日光明新區(qū)公明街道塘尾面前嶺1排8棟的潘××被盜竊案的現(xiàn)場煙頭通過DNA串并案，并比中廣西壯族自治區(qū)河池市羅城仫佬族自治縣東門鎮(zhèn)的前科人員吳×福。

2 討論

由于葡萄皮本身面積太小，為吸附性載體，上面附有的少量口腔上皮脫落細胞不宜用棉簽、紗布等擦拭轉(zhuǎn)移，直接消化應(yīng)為較好選擇。葡萄皮的主要成分為纖維素、果膠質(zhì)、鐵等，葡萄皮呈紫色是因為葡萄皮含有花青素。經(jīng)骨骼裂解液的消化裂解后，葡萄皮成為糊狀，釋放出有機酸等物質(zhì)抑制PCR反應(yīng)，消化液顏色變?yōu)榱俗仙枰獫饪s富集DNA。直接取裂解后的3ul DNA溶液用AmpFLSTRRIdentifilerRPlus試劑盒擴增未檢出結(jié)果，說明葡萄皮含有的色素、經(jīng)骨骼裂解液消化裂解后產(chǎn)生的有機酸及其他成分對擴增有抑制作用。故選擇合適的純化濃縮方法成為葡萄皮上DNA檢驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵因素。

德國QIAGEN公司的QIAquickRPCR Purification Kit純化試劑盒原用于純化片段大小在100bp-10kb之間的PCR擴增產(chǎn)物，最大處理量為10ug以便于后期測序。通過法醫(yī)DNA檢驗測試，該純化試劑盒在PCR擴增前對疑難微量檢材、陳舊骨骼牙齒樣本等的擴增前純化濃縮也取得了很好的效果，由于該純化試劑盒完全手工操作，不需要大型昂貴儀器設(shè)備，在全國公安法醫(yī)DNA實驗室應(yīng)用廣泛。通過方便的結(jié)合-洗滌-洗脫步驟可快速純化目標DNA片段，先將已消化裂解的DNA樣本加入5倍體積的Buffer PB、混勻，以增強濾過時目標DNA與純化柱硅膠膜的充分完全結(jié)合，通過離心初步去除DNA樣本中的雜質(zhì)、抑制劑，再通過Buffer PE（試劑瓶中55ml的Buffer PE使用前預(yù)先加入220ml的無水乙醇并混勻后方可使用）、80%乙醇洗滌去除附在硅膠膜上的少量殘余雜質(zhì)、抑制劑，此時硅膠膜上只結(jié)合有純凈的目標DNA，然后再通過已在65℃預(yù)熱的30ul Buffer EB從硅膠膜柱上充分完全洗脫下來擴增備用。

葡萄皮作為非傳統(tǒng)生物物證在犯罪現(xiàn)場由于體量小較少有被發(fā)現(xiàn)和提取，而且因為STR檢出成功率較低，國內(nèi)外報道不多，本文由于現(xiàn)場勘查時及時發(fā)現(xiàn)并提取送檢，采用了純化濃縮DNA效果較好的QIAquickRPCR Purification Kit硅膠膜過柱法處理檢材，得到正確STR分型結(jié)果，并通過DNA數(shù)據(jù)庫串并案件和直接比中犯罪嫌疑人，發(fā)揮了重要作用。

2012.9.26深圳市光明新區(qū)新陂頭村入室盜竊案葡萄皮STR分型結(jié)果

[1] 凃政，劉志芳，陳松，等.牙齒的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技術(shù)，2007，（5）.

[2]百度百科[EB/OL].http://baike.baidu.com/view/ 1624883.htm，2013-6-20.

[3]郭麗萍，劉建興，李楨，等.復(fù)合擴增云南明朝古尸DNA分析[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，（3）.

（責(zé)任編輯：于 萍）

D919

A

2013-11-22

王鳳寬（1975-），男，河南臺前人，深圳市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所副主任法醫(yī)師，碩士，主要從事法醫(yī)學(xué)研究。