山楂葉中總黃酮的浸提工藝研究

曹樂民，周志強(qiáng)，崔俊林，石明生*

（1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 404001）

山楂葉為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.var.maior N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥葉。藥理及臨床試驗(yàn)表明，山楂葉中黃酮類化合物具有降血壓、調(diào)血脂、增加冠脈流量、改善心肌供血供氧等作用，對高血壓、高血脂、冠心病及心絞痛等心血管疾病均具有良好療效。山楂葉總黃酮在應(yīng)用及含量測定時(shí)常用的方法有水提法和乙醇溶液提取法2種，本試驗(yàn)考察了山楂葉的采摘時(shí)節(jié)、溫度、pH值、料液比、提取時(shí)間等因素對山楂葉中總黃酮提取率的影響，得出了水提法最優(yōu)的提取工藝，為山楂葉中黃酮類物質(zhì)的提取和使用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的蘆丁：西安融升生物科技有限公司購買；山楂葉（A采果后9月下旬綠葉；B落葉前綠葉；C落葉）：太行山上采摘；氫氧化鈉NaOH（分析純）、亞硝酸鈉Al（NO）3（分析純）、硝酸鋁Al（NO）3（分析純）：成都科龍化工試劑廠；蒸餾水：pH 7.0～8.0。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4型數(shù)顯水浴鍋：金壇市杰瑞爾電氣有限公司；圓底燒瓶、容量瓶、稱量瓶、移液管：北京匯?？苾x科技有限公司；DHG-9053A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海合恒儀器設(shè)備有限公司；7200型分光光度計(jì)：上海尼龍柯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

稱取20.8mg蘆丁，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶解并稀釋至100mL，作為對照品溶液。精密量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分別置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%NaNO2溶液1mL，使混勻放置6min，然后用1mL移液管移取10%的Al（NO）3溶液1mL，使混勻放置6min，然后用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，搖勻放置15min，并做空白對照。按分光光度法在波長500nm處測定吸光度值，所取標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸光度值數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得回歸方程：y=11.687 265x-0.008 186，R=0.999 719，結(jié)果表明，蘆丁濃度為0.008 3～0.049 92mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 提取

試探試驗(yàn)：經(jīng)初步試驗(yàn)得出浸提液在稀釋50倍時(shí)，其吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值范圍之內(nèi)。

優(yōu)化試驗(yàn)依次對樣品A、樣品B、樣品C進(jìn)行浸提。

提取步驟：

水體和底層溶氧低、水體易分層、水體交換能力差：①多開增氧機(jī)和爬水機(jī)，滾動(dòng)和震動(dòng)水體，促進(jìn)水體上下層交換，防止溶氧、水溫分層，工作基本點(diǎn)必須圍繞溶氧。增氧機(jī)并不產(chǎn)氧，而是起到活絡(luò)水體和輸送氧的作用，70%以上的溶氧是依靠藻類光合作用生產(chǎn)提供的，可見適時(shí)適量培藻，保持藻類新陳代謝非常重要。②水質(zhì)好壞決定溶氧高低。藻相的好壞決定了水色，水色的好壞可以判斷溶氧的高低，所以冬棚養(yǎng)殖一定要養(yǎng)護(hù)好水質(zhì)，才能保證溶氧充足。需對水質(zhì)不定期的修復(fù)和保養(yǎng)，千萬不要等到水質(zhì)變壞了才去調(diào)改，既費(fèi)成本又很難調(diào)。

干燥山楂葉→除雜→破碎→浸提→過濾→濾液→測定。

具體操作：

①稱樣：每次稱取樣品10.00g置于圓底燒瓶中，共16組，每組2個(gè)樣品；②加堿液：按表1和表2要求向圓底燒瓶中加0.5%NaOH溶液；③加水：按表1和表2要求向1號～16號的燒瓶中加蒸餾水；④浸提：準(zhǔn)備8臺水浴鍋，設(shè)定溫度。待水溫達(dá)到指定溫度后放置樣品，每2個(gè)平行樣品放置在水浴鍋的對角位置；⑤計(jì)時(shí)：按表1和表2要求給1號～16號的樣品計(jì)時(shí)；⑥過濾：提取結(jié)束后過濾，靜置冷卻至常溫且無沉淀。

1.3.3 樣品測定

用1mL移液管取靜置冷卻后的濾液1mL至250mL容量瓶中，再用5mL移液管移取5mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，用1mL移液管移取5%的NaNO2溶液1mL，混勻后放置6min，用1mL移液管移取10%的Al（NO）3溶液1mL，混勻后放置6min，用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，搖勻后放置15min。移取上清液1mL至50mL容量瓶中，并用蒸餾水稀釋定容，然后進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)因素水平及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品濾液黃酮含量。對樣品A、樣品B、樣品C分別測定。正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 山楂葉中總黃酮浸提工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from hawthorn leaves

2.2 樣品提取結(jié)果與分析

2.2.1 樣品A最佳提取條件的確定

由表2可知，各因素對吸光度值影響程度的主次順序?yàn)榻釡囟?、浸提時(shí)間、料液比、pH值，并得出樣品A在浸提溫度90℃，浸提時(shí)間3h或4h，料液比1∶25，pH值為8.5時(shí)提取率最高，被確定為最優(yōu)組合，考慮提取成本，提取時(shí)間最終確定為3h，即最優(yōu)組合為A4B3C4D3。

2.2.2 樣品B最佳提取條件的確定

對樣品B進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表2 樣A提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from sample A

表3 樣B提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from sample B

由表3可知，各因素對吸光度值影響程度的主次順序?yàn)榱弦罕?、浸提溫度、浸提時(shí)間、pH值，并確定樣品B在浸提溫度90℃，料液比1∶20，浸提時(shí)間3h或4h，pH值8.5時(shí)樣品的吸光度值最大，即提取液中黃酮類物質(zhì)含量更高?？紤]提取成本，提取時(shí)間最終確定為3h，即最優(yōu)組合為A3B3C4D3。從表3中樣品的吸光度值經(jīng)計(jì)算得出，樣品B較樣品A中黃酮含量高。

2.2.3 樣品C最佳提取條件的確定

對樣品C進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 樣C提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from sample C

由表4可知，各因素對吸光度值影響程度的主次順序?yàn)樘崛囟取⒘弦罕?，提取時(shí)間、pH值，并確定樣品C在浸提溫度90℃，料液比為1∶20，浸提時(shí)間為3h或4h，pH值為8.0或8.5時(shí)樣品的吸光度值最大，即黃酮類物質(zhì)提取率最高。

2.3 采樣時(shí)期對黃酮提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果得出，樣品B中的黃酮類提取率最高，其次是樣品A，最后是樣品C。即不同的采樣時(shí)期對黃酮的提取率有較大的影響。因此，建議采集山楂葉的時(shí)期在山楂收獲前，采摘還沒有脫落的葉子來進(jìn)行黃酮的提取。從黃酮溶液的口感及提取效率考慮，確定最優(yōu)組合為A3B3C4D3。

2.4 樣品B中黃酮物質(zhì)總含量

使用樣品B的最優(yōu)提取工藝對樣品B進(jìn)行2次提取，最終確定樣品B中黃酮物質(zhì)測定如表5所示，2次黃酮物質(zhì)提取率分別為x1和x2。

表5 樣品B優(yōu)化工藝提取結(jié)果Table 5 Results and extraction result of optimization process from sample B

經(jīng)計(jì)算得出，每10g樣品B前后2次提取黃酮類物質(zhì)含量分別為x1=0.800 0g，x2=0.237 5g，故每10g山楂葉提取總黃酮含量為1.037 5g，山楂葉中總黃酮提取率為10.375%。

3 結(jié)論

經(jīng)以上3次試驗(yàn)可知樣品A、樣品B、樣品C山楂葉樣品中，樣品B中黃酮含量最高，并通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析得出最優(yōu)浸提條件為A3B3C4D3，即山楂采摘前的山楂葉中總黃酮提取率最高，并得出最佳提取工藝為浸提溫度90℃，pH值8.5，料液比1∶20，浸提時(shí)間3h時(shí)，可將山楂葉中的黃酮類物質(zhì)有效提取。試驗(yàn)得出山楂采摘前的山楂葉中總黃酮提取率為10.375%。

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