湖南民間酒釀中酵母菌多樣性的研究

閆華文，陳 璐，姚淑敏*

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

酒釀（sweet ferment rice）為江、浙、滬一帶的“白糟”，可習(xí)慣上稱為“香糟”，其味甘、性溫，可益氣、生津、活血、散結(jié)、消腫[1]。酒釀富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、B族維生素、礦物質(zhì)等人體必需的營養(yǎng)成分[2]，具有健身、暖胃、維持腸道菌種平衡、美容等功效。其中B族維生素有促進(jìn)乳汁分泌的作用，而少量的酒精具有促進(jìn)血液循環(huán)，有助消化及增進(jìn)食欲的功能[3]。酒釀種類繁多，其制作過程大致相同，都需要添加一種發(fā)酵劑，即酒曲。

近年來，隨著人們對酒釀的認(rèn)識的提高，在不同的地區(qū)都有了酒釀的制作，并且各大商場都有銷售，即酒釀的制作有工業(yè)化的趨勢。但因傳統(tǒng)制酒釀條件簡單，受環(huán)境影響很大，不同地區(qū)制得的酒釀營養(yǎng)成分、微生物的組成也有所不同，這樣無法保證酒釀品質(zhì)的穩(wěn)定性，也無法保證酒釀中有效微生物的組成和數(shù)量，甚至可能含有害微生物[4]，從而導(dǎo)致酒釀制造過程的不可控性和質(zhì)量的不穩(wěn)定性。酵母菌包括釀酒酵母和非釀酒酵母[5]，是酒釀中主要的功能微生物之一。酒釀中酵母菌組成的研究，對提高酒釀的質(zhì)量及進(jìn)一步弄清其對酒釀品質(zhì)的影響有重要意義。

酵母菌的常規(guī)鑒定主要依賴于形態(tài)和生理生化特征等表型特征，然而這些表型特征會隨著環(huán)境的變化有所改變，從而造成菌株鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定。隨著DNA分析技術(shù)的日漸成熟，利用rDNA鑒定菌種已經(jīng)廣泛被應(yīng)用[6-8]，特別是模式菌株的18S rDNA、26S rDNA的D1/D2區(qū)域很多已經(jīng)被公布于GenBank/EMBL等國際核酸序列庫，這使酵母菌的分類鑒定更加快捷和準(zhǔn)確。26S rDNA的D1/D2區(qū)域位于大亞基的5′端，序列長度在600bp左右，擴(kuò)增常用通用引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3′。GUTEL LR R等[9]研究表明這段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類研究。對大量子囊菌酵母模式菌種的26S rDNA的D1/D2的序列分析發(fā)現(xiàn)，同種內(nèi)不同菌株D1/D2區(qū)核苷酸替換率一般不超過1%，而不同種菌株其核苷酸替換率一般較大，因此可以作為酵母菌種級水平鑒定指標(biāo)。本實驗利用26S rDNA序列對所分離的酵母菌進(jìn)行鑒定并結(jié)合生理生化特征探討了酒釀中酵母菌的多樣性，為酒釀的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒曲

酒曲：湖南韶山、湘潭、祁東民間酒曲。

1.1.2 培養(yǎng)基[10]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，瓊脂2%，用于分離酵母菌。

溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，用于分子生物學(xué)鑒定。

碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母粉0.02%，（NH4）2SO40.5%，KNO30.78%，分裝5mL/管。

氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5%，NaCl0.01%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，CaCl2·2H2O 0.01%，酵母粉0.02%，碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖）0.5%，分裝5mL/管。

醇類同化培養(yǎng)基：酵母膏0.01%，MgSO4·7H2O 0.025%，KH2PO40.05%，（NH4）2SO40.25%，分裝5mL/管+2滴醇（山梨醇、乙醇、甘油、赤蘚醇）。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1～2mL，pH7.6，分裝試管5mL/管+1mL糖（葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、棉籽糖）+杜氏管。

1.1.3 其他

大腸桿菌DH5α：實驗室保存；氨芐青霉素，TaqDNA聚合酶，Dntp，10×buffer，2 000bp Marker，引物（NL1和NL4）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HNY-1102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；A300型ArtGeneTM 基因擴(kuò)增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；StarPrep 膠回收試劑盒：北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；DYY-6C 瓊脂糖水平電泳板：北京六一儀器廠；Tanon 2500 凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

采取梯度稀釋的方法。取0.5g酒曲樣品，倒入裝有50mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，振蕩20～30min，制成10-1濃度的稀釋液。然后按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離，即用移液槍取0.5mL 10-2濃度稀釋液加入到裝有4.5mL滅菌蒸餾水的小試管中，充分混勻，制得10-3稀釋液，采用同樣方法依次獲得10-3、10-4、10-5、10-6濃度的稀釋液。分別將上述6個濃度的稀釋液，用移液槍移取0.1mL于不同的YPD固體培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒在超凈工作臺上將其涂布均勻，作標(biāo)記，30℃恒溫培養(yǎng)，12d后觀察并記錄，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.2 形態(tài)觀察

參照《酵母菌分類學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法》對供試菌株在形態(tài)上進(jìn)行觀察，進(jìn)行初步鑒定[11]。

1.3.3 生理生化分析

將分離得到的9株菌株分別接種到糖發(fā)酵培養(yǎng)基、氮源同化培養(yǎng)基、碳源同化培養(yǎng)基和醇類同化培養(yǎng)基中，觀察菌株的利用情況。

1.3.4 基因組總DNA的提取[12]

參照《基因工程實驗指導(dǎo)》上介紹的酵母菌基因組提取方法，對篩選的酵母菌進(jìn)行基因組的提取。

1.3.5 26S rDNA擴(kuò)增及測序

以制備的酵母菌基因組為模板，以26S rRNA的通用引物，進(jìn)行擴(kuò)增。

NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）為上游引物。

NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）為下游引物。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆，將具有陽性克隆的樣品送至上海生物工程公司測序完成。將測序結(jié)果登錄美國國立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）用BLAST程序進(jìn)行序列比對。比對之后用MEGA5建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。以便確定分離菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌形態(tài)觀察

經(jīng)過分離，從湖南酒曲中共分離出35株酵母菌菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定，這35株酵母菌中有一些是序列相同的菌株，通過比對最終確定為9株菌株，分別為A、C、I、L、M、N、O、P、R。所分離的酵母菌的個體形態(tài)見圖1。

圖1 酵母菌個體形態(tài)Fig.1 Colonial individual form of yeast

2.2 酵母菌菌株的生理生化

經(jīng)過對這9株酵母菌進(jìn)行糖發(fā)酵、碳源同化、醇類同化、氮源同化的實驗，結(jié)果見表1。從表1可以看出，這9株酵母菌的對糖、醇、醛及氮源的利用結(jié)果有所不同，這說明不同酒曲發(fā)酵的甜酒釀的口感和成分也不同，因此發(fā)酵后的酒釀的風(fēng)味各有不同。后續(xù)工作將繼續(xù)研究不同的酒釀中的非酵母菌菌株的多樣性和酒釀中的蛋白質(zhì)、多糖、灰分、氨基酸、有機(jī)酸等的不同之處，從而為工業(yè)發(fā)酵提供理論依據(jù)。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

表1 酵母菌的形態(tài)和生理生化特征Table 1 Morphological,physiological and biochemical characteristics of yeast

圖2 26S rDNA PCR結(jié)果Fig.2 PCR result of 26S rDNA

利用26S rDNA的通用引物通過PCR擴(kuò)增出600bp左右的條帶，結(jié)果見圖2，將PCR產(chǎn)物割膠回收，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆，將具有陽性克隆的樣品送至上海生物工程公司測序，將所測的序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示A與畢赤克魯酵 母LY9AB499014.1 相 似 性 達(dá) 到99%，M 和P 菌 株 與LY9AB499014.1菌株的相似性分別為98%和97%，菌株R與畢赤克魯酵母CEC RCS-0-9JX103190.1菌株相似性達(dá)99%。菌株O、I、C分別和釀酒酵母D3C JF715188.1、HA1835 AM262820.1、JN7N-19KC715802.1菌株相似度達(dá)到97%、98%、99%，而菌株N、L和釀酒酵母YJM789 JQ277730.1菌株相似度達(dá)到98%和99%，由此可見，從酒釀中分離的菌株多為釀酒酵母和畢赤酵母，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果見圖3。

3 結(jié)論

對來自福建、江蘇、湖南、上海、浙江等地的酒釀做了初步的菌種鑒定，從結(jié)果可以看出，在福建酒曲、蘇州蜂蜜和安琪酒曲中的酵母菌主要是釀酒酵母和覆膜酵母[1]，而在湖南酒曲中主要分離得到的酵母菌是釀酒酵母和畢赤酵母，由此可以了解在酒釀中其主要作用的是釀酒酵母，而非釀酒酵母在其中的作用有待進(jìn)一步的實驗驗證。從實驗中還分離得到一些霉菌，對這些菌株的驗證正在進(jìn)行中。接下來的工作重點將進(jìn)行酵母菌發(fā)酵的條件優(yōu)化，優(yōu)勢菌株的發(fā)酵機(jī)制以及酵母菌和其他非酵母菌之間發(fā)酵相關(guān)性的研究。

圖3 酵母菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast

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