不同分級的慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化狀態(tài)及蛋白表達的研究

王 倍 趙春娜 張麗麗 郭 楓 肖麗麗 張春華

（黑龍江省大慶市大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163411）

不同分級的慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化狀態(tài)及蛋白表達的研究

王 倍 趙春娜 張麗麗 郭 楓 肖麗麗 張春華

（黑龍江省大慶市大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163411）

目的探討不同分期慢性萎縮性胃炎（CAG）患者Runx3基因啟動子甲基化狀態(tài)，并分析與Runx3蛋白表達的相關(guān)性。方法搜集150例疑似CAG患者進行胃鏡檢查，取少許胃黏膜進行病理檢查，依據(jù)病理結(jié)果將人群分為胃黏膜正常組、胃黏膜輕度、中度及重度改變4組人群，采用Sequenom公司的基質(zhì)支持的激光釋放/電離飛行時間質(zhì)譜分析方法（MALDI-TOF MS）測定Runx3啟動子甲基化狀態(tài)；ELISA方法測定Runx3蛋白的表達。結(jié)果經(jīng)病理檢查胃黏膜正常組30例，胃黏膜輕度改變62例，中度改變23例，重度改變35例，CAG患者的Runx3基因啟動子甲基化明顯高于正常組（P＜0.05）；且在不同分級中的甲基化狀態(tài)也不同（P＜0.05）；Runx3基因啟動子甲基化與蛋白表達呈明顯的負相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論Runx3基因甲基化狀態(tài)與CAG的分期嚴重程度呈正相關(guān)，且會造成其蛋白表達量的降低。

慢性萎縮性胃炎；Runx3基因甲基化狀態(tài)；蛋白表達

慢性萎縮性胃炎（CAG）是一種胃黏膜發(fā)生萎縮性改變的慢性胃炎，具體的發(fā)病機制尚不是非常的清楚，但隨著幽門螺旋桿菌感染率的增高，環(huán)境污染物加重及不健康的生活方式如高脂、高鹽飲食、蔬菜水果攝入不足等問題的凸顯，使得我國CAG的患病率呈上升趨勢，成為困擾數(shù)百萬人的常見胃部疾病[1-3]。長期的CAG改變可導(dǎo)致機體胃癌發(fā)病率的增高，1978年世界衛(wèi)生組織已將CAG列為胃癌的癌前狀態(tài)，可見尋找早期CAG癌前病變對降低其胃癌的發(fā)病率有很大的幫助，從而達到早期預(yù)防及治療的作用，是對臨床工作的推動。

1 對象與方法

1.1 研究對象

大慶油田總醫(yī)院消化科2013年6月至2013年10月150例疑似CAG患者，所有選取的研究對象均經(jīng)過嚴格的納入和排除標準進行篩選，納入標準：所有患者均具有CAG相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。排除標準為：近期有細菌或病毒感染，有心、肝、腎及血液系統(tǒng)相關(guān)疾病，經(jīng)期或孕期婦女。所有研究對象均簽署相應(yīng)知情同意書。

1.2 生物樣品的收集

對所有滿足納入和排除標準的150例研究對象進行胃鏡檢查并取相應(yīng)組織做病理檢查，結(jié)合病理分型，將150例研究對象分為胃黏膜正常組、胃黏膜輕度、中度及重度改變四組人群。采集所有研究對象外周靜脈血2 mL，分裝于兩支EDTA抗凝管中，一份立即離心收集其血清用于Runx3蛋白含量的測定，另一份用于提取DNA，測定Runx3基因啟動子甲基化的狀況，在整個分析過程中采用嚴格的質(zhì)量控制，所有生物樣品均儲存與-80 ℃低溫冰箱中。

1.3 Runx3基因啟動子甲基化測定

用天根DNA提取試劑盒提取外周靜脈血中的DNA，經(jīng)過定量、純度檢測后，采用sequenom公司的基因分析系統(tǒng)，用基質(zhì)支持的激光釋放/電離飛行時間質(zhì)譜分析方法測定基因啟動子的甲基化定量分析。先用亞硫酸氫鈉進行修飾，由zymo公司提供，其他后續(xù)過程所需試劑和芯片均來自sequenom公司，CPG島序列參照UCSC數(shù)據(jù)庫，引物由sequenom相應(yīng)設(shè)計軟件Epidesigner設(shè)計，上海生物工程公司合成，結(jié)合相應(yīng)的參考文獻，正向序列為aggaagagag TTACGAGGGGCGGTCGTACGC，反向序列為cagtaatacgactcactataggg agaaggctAAAACGACCGACGCGAACGCCTCC。

1.4 Runx3蛋白表達情況

選用ELISA試劑盒測定Runx3蛋白含量，具體的實驗步驟參照說明書進行，試劑盒購買于Abcom公司。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

選用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)用（xˉ±s）表示，定性資料選擇構(gòu)成比表示，獨立樣本t檢驗、方差分析等研究調(diào)查對象之間年齡的差別，甲基化狀態(tài)及蛋白表達量的差別，采用χ2檢驗分析兩組研究對象吸煙、飲酒的差異，假設(shè)檢驗水準定為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的基本概況

根據(jù)病理學(xué)結(jié)果，將將150例研究對象分為胃黏膜正常組、胃黏膜輕度、中度及重度改變四組人群。對這4組人群的基本情況進行分析，包括年齡、吸煙及飲酒方面，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，均衡可比。

2.2 4組人群中Runx3基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)的分析

正常組甲基化率為（6.7±2.4）%，輕度改變組甲基化率為（10.0 ±8.8）%，中度改變組甲基化率為（18.3±9.3）%，重度改變組甲基化率（23.4±12.1）%。Runx3啟動子CpG島甲基化陽性表達率在CAG患者明顯高于胃黏膜正常組（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改變組甲基化率明顯高于正常組和輕度改變組（P＜0.05），但胃黏膜輕度改變組與正常組之間，中度改變組與重度改變組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 4組人群中Runx3蛋白的表達

Runx3蛋白的濃度在CAG患者明顯低于胃黏膜正常組（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改變組甲基化率明顯低于正常組和輕度改變組（P＜0.05），但胃黏膜輕度改變組與正常組之間，中度改變組與重度改變組之間無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

表1 4組人群的Runx3蛋白表達的比較分析

3 討 論

Runx3基因是Runx家族主要成員之一，是一種常見的抑癌基因。位于人的1號染色體上，該基因的轉(zhuǎn)錄受兩種結(jié)構(gòu)的啟動子控制，內(nèi)含大量的CPG島的保守序列，這種CPG島的甲基化的改變可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程受阻，可影響Runx3蛋白的分泌，而Runx3蛋白是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞生長的負調(diào)控。Runx3蛋白缺失會導(dǎo)致TGF-β1引導(dǎo)的信號通路阻斷，細胞對TGF-β1誘導(dǎo)的生長抑制作用和凋亡反應(yīng)能力下降，最終影響到胃腸道上皮細胞的正常生長。目前國內(nèi)外研究均已發(fā)現(xiàn)在多種消化道腫瘤特別是胃癌中均可能存在Runx3基因啟動子甲基化的改變，而CAG作為一種癌前病變，可會存在Runx3基因甲基化的改變，本研究也已證實Runx3啟動子CpG島甲基化陽性表達率在CAG患者明顯高于胃黏膜正常組（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改變組甲基化率明顯高于正常組和輕度改變組（P＜0.05），但胃黏膜輕度改變組與正常組之間，中度改變組與重度改變組之間無顯著性差異，可見隨著胃黏膜損傷嚴重程度的增加，啟動子甲基化水平明顯的增高。

此外本研究也已發(fā)現(xiàn)隨著胃黏膜損傷程度的增加會伴有Runx3蛋白分泌量的降低，特別是中度及重度胃黏膜改變的CAG患者，與甲基化程度呈明顯的負相關(guān)。

總之，隨著胃黏膜損傷的改變，Runx3基因啟動子甲基化可明顯的升高，且其甲基化的改變可能是蛋白表達缺失的主要原因，因此Runx3基因啟動子甲基化可作為估計胃黏膜損傷程度的生物標志物，有助于胃黏膜損傷的早期診斷，從而盡早的選取合理的臨床治療方法，降低所致胃癌的發(fā)病率。

[1] 姜貽興.慢性非萎縮性胃炎的飲食和環(huán)境因素分析[J].中國醫(yī)藥指南,2011,21(1):73-76.

[2] 康文全,趙成忠,張厚德,等.慢性非萎縮性胃炎與組織學(xué)、幽門螺桿菌、胃泌素和表皮生長因子相關(guān)性研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,1999,2(1):102-105.

[3] 鄭小梅,伍寧豐.DNA甲基化作用的生物學(xué)功能[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2009,11(1): 33-39.

R573.3+<2 文獻標識碼：B class="emphasis_bold">2 文獻標識碼：B 文章編號：1671-8194（2014）17-0131-022 文獻標識碼：B

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