大鼠脊髓半橫斷損傷對(duì)脊髓神經(jīng)元EGFL7表達(dá)的影響

萬(wàn) 一黃純海* 張 方田 志張晶晶

（1 吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 吉首 416000；2 吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)科，湖南 吉首 416000）

大鼠脊髓半橫斷損傷對(duì)脊髓神經(jīng)元EGFL7表達(dá)的影響

萬(wàn) 一1黃純海1* 張 方2田 志1張晶晶1

（1 吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 吉首 416000；2 吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)科，湖南 吉首 416000）

目的探討和分析大鼠脊髓半橫斷損傷對(duì)脊髓神經(jīng)元EGFL7表達(dá)的影響。方法65只成年SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、脊髓損傷組；建立脊髓半橫斷損傷模型（胸9～胸10），免疫組化法檢測(cè)大鼠脊髓EGFL7表達(dá)。結(jié)果未發(fā)生脊髓損傷，EGFL7表達(dá)于腹角Ⅸ板層的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背角Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ板層的小神經(jīng)元；脊髓半橫斷損傷后，灰質(zhì)神經(jīng)元EGFL7表達(dá)水平隨著時(shí)間逐漸增加，7 d達(dá)到高峰，隨后降低，21 d后維持穩(wěn)定；脊髓損傷組脊髓神經(jīng)元EGFL7免疫組化IRS評(píng)分與對(duì)照組比較具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論EGFL7的表達(dá)變化與脊髓運(yùn)動(dòng)功能改變具有相關(guān)性，其可能參與脊髓損傷再生修復(fù)過(guò)程。

類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子域7；脊髓損傷；大鼠

經(jīng)研究表明，缺氧預(yù)處理大鼠腦組織EGFL7表達(dá)顯著上調(diào)并伴隨微血管密度增加[1,2]；氧暴露新生大鼠的肺組織內(nèi)皮細(xì)胞中明顯下降，減少氧暴露可回復(fù)正常表達(dá)水平；在體外培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中，高氧暴露明顯下調(diào)EGFL7表達(dá)，EGFL7表達(dá)與缺氧及其誘導(dǎo)的血管新生過(guò)程相關(guān)。因此，本研究通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性大鼠脊髓半橫斷損傷模型，免疫組化法分析急性期和恢復(fù)期神經(jīng)元組織EGFL7表達(dá)變化和下肢功能恢復(fù)狀況，進(jìn)而探討EGFL7在脊髓損傷急性期的神經(jīng)元功能維持和神經(jīng)元損傷修復(fù)過(guò)程的作用，為進(jìn)一步探討脊髓損傷再生修復(fù)的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型構(gòu)建

成年的健康清潔級(jí)雄性SD大鼠65只，體質(zhì)量為（205.6±26.3）g，按隨機(jī)分為3組，分別是正常對(duì)照組（5只）、假手術(shù)組（30只，分別于2、3、7、14、21、30 d進(jìn)行脊髓樣本取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只）、脊髓損傷模型組（30只，分組大鼠數(shù)量同假手術(shù)組）。戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，于胸9～10節(jié)段水平制作脊髓半橫斷損傷模型，假手術(shù)組不損傷脊髓，僅剪開(kāi)硬脊膜后縫合。

1.2 灌注、固定及取材

脊髓半切損傷建模手術(shù)后，于術(shù)后2、3、7、14、21、30 d分別進(jìn)行脊髓組織取材。按常規(guī)動(dòng)物取材方法，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開(kāi)胸、于胸9～10節(jié)段選取脊髓組織，福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，取首尾各一張切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色行顯微鏡下觀(guān)察確定該系列連續(xù)切片為相應(yīng)脊髓神經(jīng)元組織，切片用于后期的免疫組化分析。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定

常規(guī)HE染色連續(xù)切片證實(shí)的脊髓神經(jīng)元的組織切片行免疫組化染色（ABC法）。大鼠EGFL7-抗為上海生工產(chǎn)品（濃度為1∶500）4 ℃置2 d；二抗（1∶200）37 ℃置1.5 h，DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗藍(lán)化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。結(jié)果判定及計(jì)數(shù)，鏡下觀(guān)察，胞質(zhì)呈棕黃色為EGFL7免疫陽(yáng)性細(xì)胞。以中央管為中心，與脊髓前后正中溝相垂直作一直線(xiàn)，每只大鼠隨機(jī)取5張切片，在光鏡下計(jì)數(shù)其中一邊腹側(cè)灰質(zhì)中有明顯細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性產(chǎn)物表現(xiàn)為境清楚突出背景棕黃色或棕褐色顆粒。脊髓免疫組化計(jì)分采用IRS法，并略作修改：在高倍鏡（×200）計(jì)數(shù)前角細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和二者計(jì)分的乘積進(jìn)行綜合判斷，圖像分析采用試用版Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0 進(jìn)行分析，采用百分比、均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，組間比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對(duì)照組、假手術(shù)組（2、3、7、14、21、30 d）、脊髓半橫斷損傷組（2、3、7、14、21、30 d）灰質(zhì)神經(jīng)元EGFL7的免疫組化IRS評(píng)分比較（表1）。

表1 灰質(zhì)神經(jīng)元EGFL7的免疫組化IRS評(píng)分比較（n=65）

3 討 論

EGFL7是一種新發(fā)現(xiàn)的由特異性?xún)?nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性因子，其基本生理功能是胚胎發(fā)育和血管損傷時(shí)促進(jìn)血管生成。然而，隨著研究深入發(fā)現(xiàn)EGFL7也在多種細(xì)胞類(lèi)型中存在表達(dá)，包括胚胎干細(xì)胞、精原細(xì)胞、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元及某些上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞等。大量的研究結(jié)果和本研究組前期研究結(jié)果均提示，EGFL7表達(dá)與缺氧及其誘導(dǎo)的血管新生過(guò)程密切相關(guān)。脊髓半橫斷損傷過(guò)程伴隨最顯著的病理生理過(guò)程即存在缺血缺氧損傷過(guò)程，缺氧所誘導(dǎo)的新生血管廣泛存在于脊髓半橫斷損傷修復(fù)過(guò)程。因此，我們通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性脊髓半橫斷損傷模型并采用同期BBB功能評(píng)定法和EGFL7染色免疫組化法定量分析脊髓半橫斷損傷修復(fù)過(guò)程中EGFL7表達(dá)與脊髓損傷修復(fù)的相關(guān)性。

本研究結(jié)果提示，EGFL7可能在維持正常脊髓神經(jīng)元功能及損傷后的修復(fù)的一種潛在的脊髓神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)因子，但在正常脊髓神經(jīng)元中是否具有參與調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性和維持足夠數(shù)量神經(jīng)元存活的作用還需進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓半橫斷損傷后，EGFL7表達(dá)從3 d后顯著上調(diào)，一直持續(xù)到傷后21 d（表1），其表達(dá)水平與大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)呈顯著負(fù)相關(guān)（R2=0.619，r=-0.787，P=0.016）。該結(jié)果提示，EGFL7可能參與脊髓神經(jīng)損傷修復(fù)和可塑性調(diào)節(jié)過(guò)程。EGFL7的功能具有組織和細(xì)胞特異性，其功能可能涉及神經(jīng)細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附、缺氧存活、血管生成，以及免疫調(diào)節(jié)等病理和生理過(guò)程。本研究結(jié)果提示，脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)過(guò)程與脊髓神經(jīng)元表達(dá)EGFL7水平呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能在于血管損傷或缺氧刺激神經(jīng)元表達(dá)EGFL7，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的群集性遷移而參與血管新生。

綜上所述，本文結(jié)果初步提示，EGFL7可能參與維持正常脊髓神經(jīng)元功能，并可能在脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用。

[1] Fitch MJ,Campagnolo L,Kuhnert F,et al.Egfl7,a novel epidermal growth factor-domain gene expressed in endothelial cells[J].Dev Dyn,2004,230(2):316-324.

[2] Gustavsson M,Mallard C,Vannucci SJ,et al.Vascular response to hypoxic preconditioning in the immature brain[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):928-938.

R651.2

B

1671-8194（2014）17-0079-02

湖南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（應(yīng)用基礎(chǔ)研究科技專(zhuān)項(xiàng)：2011FJ6050）；湘西州科技計(jì)劃項(xiàng)目

*通訊作者：E-mail:huangchunhai2001@126.com