SCNN1G基因和IL1B基因多態(tài)性與漢族男性先天性雙側(cè)輸精管缺如的相關(guān)性研究*

彭玉婉程龍飛賀小進(jìn)楊曉玉王 晶

魏兆蓮1周 平1宋 兵1王彬彬3馬 旭3**曹云霞1**

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（合肥 230032）; 2. 合肥市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科; 3. 國(guó)家人口計(jì)劃生育科研所; 4. 江蘇省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

SCNN1G基因和IL1B基因多態(tài)性與漢族男性先天性雙側(cè)輸精管缺如的相關(guān)性研究*

彭玉婉1,2程龍飛3賀小進(jìn)1楊曉玉4王 晶3

魏兆蓮1周 平1宋 兵1王彬彬3馬 旭3**曹云霞1**

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（合肥 230032）; 2. 合肥市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科; 3. 國(guó)家人口計(jì)劃生育科研所; 4. 江蘇省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

目的研究非電壓門(mén)控鈉離子通道基因SCNN1G以及IL1B基因與先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）間的關(guān)系。方法通過(guò)直接測(cè)序和聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RELP）方法檢測(cè)基因多態(tài)性位點(diǎn)rs5735（SCNN1G基因）和rs3917356（IL1B基因）在109例病例和103例對(duì)照人群中的基因型頻率的分布。結(jié)果兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)在病例-對(duì)照組中的等位基因、基因型頻率分布差異無(wú)顯著性（P=0.2410,P=0.1701 rs5735;P=0.5564,P=0.0959 rs3917356）結(jié)論SCNN1G基因（rs5735）、IL1B基因（rs3917356）均未發(fā)現(xiàn)與CBAVD之間存在明顯的關(guān)聯(lián)性。

輸精管/畸形; 囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子; 基因

囊性纖維化（CF）是常見(jiàn)的染色體隱性遺傳病，影響人體多種器官形成[1]。先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）是其生殖器表現(xiàn)形式，幾乎95%的男性CF患者都存在先天性雙側(cè)輸精管缺如[2]。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（CFTR）是CF的主要致病基因，近年來(lái)有些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在CF患者中具有相同CFTR基因突變確存在著不同的表型[3]，之后又有些學(xué)者推測(cè)CBAVD致病基因除了CFTR基因很可能存在其他基因變異[4]。Stanke等[5]報(bào)道編碼上皮鈉離子通道（ENaC）γ亞單位的非電壓門(mén)控鈉離子通道（SCNN1G）基因與CF表型有相關(guān)性。ENaC控制調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的鹽水平衡，共包括3個(gè)亞單位：α-ENaC、 β-ENaC和γ-ENaC[6]。ENaC在促進(jìn)胎肺轉(zhuǎn)化為成熟肺過(guò)程中，起著關(guān)鍵的液體平衡調(diào)節(jié)機(jī)制[7]。且ENaC通道蛋白與CFTR通道蛋白在分子水平上有相互關(guān)聯(lián)[8]，SCNN1G基因多態(tài)性位點(diǎn)rs5735和rs5723與CF病發(fā)生相關(guān)。在非洲CF患者中，也發(fā)現(xiàn)了ENaC和CFTR兩個(gè)基因的突變[9]。細(xì)胞因子白介素1b（IL1B）基因編碼促炎性細(xì)胞因子IL1β，是另外一個(gè)CF的候選基因[10]。IL1B基因是IL-1家族基因之一。在體外培養(yǎng)的人和小鼠肺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL1B基因在氣道促炎癥信號(hào)中起到關(guān)鍵作用[11]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與IL-1B基因相關(guān)SNP（rs3917356）與CF相關(guān)[12]。本研究是首次在漢族先天性雙側(cè)輸精管缺如人群中檢測(cè)SCNN1G基因、IL1B基因的等位基因、基因型頻率的分布情況，以探究其與CBAVD發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

材料與方法

本研究包括病例組109例CBAVD患者和對(duì)照組103例健康男性。病例組與對(duì)照組來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2010年6月至2012年12月期間男科門(mén)診患者。CBAVD患者由至少兩名高年資男科醫(yī)生結(jié)合生殖器體檢、生殖系統(tǒng)超聲檢查、精液常規(guī)及生化檢查和性激素檢查等做出診斷，所有患者行睪丸精子抽吸術(shù)（ TESA ）或經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（ PESA ）發(fā)現(xiàn)成熟精子。全部患者進(jìn)行Y染色體微缺失，染色體核型（46,XY）檢查分析，均正常。所有參與者均簽署研究知情同意書(shū)，并通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查（編號(hào)：2008035）。

一、實(shí)驗(yàn)方法和具體步驟

采用基因組DNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)Hilden）提取外周靜脈血基因組DNA。使用NanoDrop分光光度計(jì)（ND -2000，威爾明頓，DE）進(jìn)行DNA濃度和純度測(cè)定并標(biāo)準(zhǔn)化至25～30ng/μL。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）分析和直接測(cè)序法檢測(cè)SNP位點(diǎn)rs5735和rs3917356。PCR擴(kuò)增引物分別為：rs5735:5'-TCGCCACCTTCTAGCTGACT-3'（正向），5'-CATCTGGGCTCACTGCAAC-3'（反向），和rs3917356:5'- CGCTTTGGACCTCATCTG -3 '（正向），5'- GGCACACAGCAGGTTAGAG -3'（反轉(zhuǎn)）。熱循環(huán)條件：rs5735:預(yù)變性：95℃ 3min，40個(gè)循環(huán)（變性95℃ 40s，退火 63.1℃ 40s，延伸72℃40s），最后終延伸72℃ 7min；rs3917356：預(yù)變性95℃ 3min，40個(gè)循環(huán)（95℃ 50s，57℃ 50s，72℃55s），終延伸72℃ 7min。rs5735 PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Bam HI （ New England Biolabs公司NEB ，北京，中國(guó)）酶切37℃ 4h。RFLP產(chǎn)物通過(guò)4%瓊脂糖凝膠電泳最終確定CT雜合子基因型三個(gè)片段分別為497bp、145bp和642bp，CC純合子為497 bp和145 bp兩個(gè)片段，TT純合子為642 bp一個(gè)片段。 rs3917356通過(guò)直接測(cè)序確定基因型。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)CBAVD病例和對(duì)照組之間SCNN1G和IL-1B等位基因和基因型頻率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的卡方分析及Hardy-Weinberg平衡（HWE）測(cè)試。采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

表1顯示兩組間年齡、嗜酒與否、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），而吸煙與否、吸煙年限、接觸放射線史、左右睪丸體積均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2顯示rs5735位點(diǎn)的3種基因型CC、CT、TT及兩種等位基因C、T頻率分布在兩組中無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），rs3917356位點(diǎn)的3種基因型AA、AG、GG及兩種等位基因A、G頻率分布在兩組中亦無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2004年Helve等明確在肺疾病中，所有ENaC 亞單位mRNA表達(dá)水平均下降，其中以SCNN1G mRNA表達(dá)水平下降最為顯著[13]。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)因子蛋白（CFTR）和ENaC在控制調(diào)節(jié)氣道表面液體平衡方面起著拮抗性作用，兩者均通過(guò)對(duì)氣道上皮水和細(xì)胞內(nèi)鈉離子和氯離子分泌和吸收進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。2009年Joos等[15]對(duì)非洲55例CF患者的SCNN1G等基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，推測(cè)SCNN1G基因很可能是參與了CF患者的基礎(chǔ)缺陷以及炎癥反應(yīng)。因此，ENaC蛋白通道是導(dǎo)致CF基礎(chǔ)缺陷的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。

表 1 兩組一般臨床資料比較 n(%) （±s）

表 1 兩組一般臨床資料比較 n(%) （±s）

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.01;**P＜0.05

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=103) 病例組(n=109)年齡(歲) 32.80±4.66 29.80±5.01*吸煙是 56(54.37) 56 (51.37 )否 47(45.63) 53 (48.63)吸煙年限 4.62±5.13 4.31±5.29酗酒是 41(39.81) 9 (8.26)*否 62(60.19) 100 (91.74)放射線是 4(3.88) 2 (1.83)否 99(96.12) 107 (98.17)化學(xué)物質(zhì)接觸史是 1(0.97) 1 (0.91 )否 102(99.03) 108(99.09)體質(zhì)量指數(shù) 24.31±3.17 23.14±3.41**右側(cè)睪丸體積(mL) 14.88±2.64 15.28±3.21左側(cè)睪丸體積(mL) 14.81±2.72 15.17±3.3

表2 兩組rs3917356和rs5735位點(diǎn)基因型分布差異

IL-1B基因被證明在肺部的自發(fā)性免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，2009年Levy等[16]通過(guò)對(duì)808例CF患者進(jìn)行IL-1基因多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1B基因有陽(yáng)性多態(tài)性位點(diǎn)（rs1143643、rs1143639），Levy等推測(cè)這些陽(yáng)性位點(diǎn)可能是通過(guò)改變銅綠假單胞菌感染的敏感性來(lái)影響肺部功能的，同時(shí)這些IL-1B基因陽(yáng)性多態(tài)性位點(diǎn)可能引起超敏反應(yīng)來(lái)抵抗感染，其負(fù)面的影響即損傷了肺功能。2011年Labenski等[17]繼續(xù)探討了IL-1B基因多態(tài)性與CF之間的關(guān)聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)rs3917356和rs4848306與CF肺疾病的嚴(yán)重性相關(guān)，引人矚目的本次研究與2009年Levy等的研究樣本完全不同，基因檢測(cè)方法也不同，但是這4個(gè)SNPs均在相同的基因片段內(nèi)，更加確定了IL-1B基因多態(tài)性與CF之間有著一定的關(guān)聯(lián)性。此外，功能分析發(fā)現(xiàn)在鼻病毒感染的人鼻上皮細(xì)胞（HNECs）中，IL-1β會(huì)增加α-ENaC在肺中表達(dá)[18]，也可以激活核因子-κB（NF-κB）途徑，以改善氣道細(xì)胞CFTR表達(dá)量[19]。

依據(jù)CBAVD與CF有著共同的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，我們推測(cè)SCNN1G基因及IL1B基因可能同樣與CBAVD有關(guān)。我們選取了與CF患者中密切關(guān)聯(lián)且在中國(guó)人群中符合MAF＞0.05的多態(tài)性位點(diǎn)rs5735和rs3917356。本研究是首次在中國(guó)漢族CBAVD患者中檢測(cè)rs5735、rs3917356位點(diǎn)基因頻率分布情況。我們利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RELP）方法，對(duì)最后成功分型的109例病例組和103例對(duì)照組進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布在兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。這一結(jié)果與既往的研究結(jié)果不同[5,17]，我們推測(cè)可能原因?yàn)椋海?）不同人種的基因異質(zhì)性差異；（2）基因與基因之間的相互作用，SCNN1G、IL-1B和CFTR3個(gè)基因間可能存在共同作用的機(jī)制導(dǎo)致CBAVD的發(fā)生；（3）本研究中樣本數(shù)量有限，結(jié)果可能存在一定偏倚。在今后的研究中可通過(guò)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。

綜上所述，本研究首次在漢族CBAVD人群中檢測(cè)SCNN1G、IL-1B基因型分布情況，為進(jìn)一步探究CBAVD致病因素提供線索。

1 Strausbaugh SD, Davis PB. Cystic f brosis: a review of epidemiology and pathobiology.Clin Chest Med2007; 28 (2): 279-288

2 Anzai C, Morokawa N, Okada H,et al. CFTR gene mutations in Japanese individuals with congenital bilateral absence of the vas deferens.J Cyst Fibros2003; 2(1):14-18

3 Bronsveld I, Mekus F, Bijman J,et al.Residual chloridesecretion in intestinal tissue of deltaF508 homozygous twins and siblings with cystic f brosis. The European CF Twin and Sibling Study Consortium.Gastroenterology2000; 119(1): 32-40

4 Havasi V, Rowe SM, Kolettis PN,et al. Association of cystic f brosis genetic modif ers with congenital bilateral absence of the vas deferens.Fertil Steril2010; 94 (6): 2122-2127

5 Stanke F, Becker T, Cuppens H,et al. The TNFalpha receptor TNFRSF1A and genes encoding the amiloridesensitive sodium channel ENaC as modulators in cystic f brosis.Hum Genet2006; 119 (3): 331-343

6 Canessa CM, Schild L, Buell G,et al. Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel is made of three homologous subunits.Nature1994; 367 (6462): 463-467

7 Barker PM, Nguyen MS, Gatzy JT,et al. Role of gammaENaC subunit in lung liquid clearance and electrolyte balance in newborn mice. Insights into perinatal adaptation and pseudohypoaldosteronism.J Clin Invest1998;102(8): 1634-1640

8 Ji HL, Chalfant ML, Jovov B,et al. The cytosolic termini of the beta- and gamma-ENaC subunits are involved in the functional interactions between cystic f brosis transmembrane conductance regulator and epithelial sodium channel.J Biol Chem2000; 275(36): 27947-27956

9 Mutesa L, Azad AK, Verhaeghe C,et al.Genetic analysis of Rwandan patients with cystic f brosis-like symptoms: identification of novel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and epithelial sodium channel gene variants.Chest2009; 135(5): 1233-1242

10 Lin TJ, Garduno R, Boudreau RT,et al. Pseudomonas aeruginosa activates human mast cells to induce neutrophil transendothelial migration via mast cell-derived IL-1 alpha and beta.J Immunol2002; 169 (8): 4522-4530

11 Joki-Erkkila VP, Karjalainen J, Hulkkonen J,et al. Allergic rhinitis and polymorphisms of the interleukin 1 gene complex.Ann Allergy Asthma Immunol2003; 91 (3): 275-279

12 Levy H, Murphy A, Zou F,et al. IL1B polymorphisms modulate cystic f brosis lung disease.Pediatr Pulmonol2009; 44 (6): 580-593

13 Helve O, Pitkanen OM, Andersson S,et al. Low expression of human epithelial sodium channel in airway epithelium of preterm infants with respiratory distress.Pediatrics2004; 113(5): 1267-1272

14 Blaug S, Hybiske K, Cohn J,et al. ENaC- and CFTR-dependent ion and f uid transport in mammary epithelia.Am J Physiol Cell Physiol2001; 281 (2): C633-C648

15 Joos L, McIntyre L, Ruan J,et al.Association of IL-1beta and IL-1 receptor antagonist haplotypes with rate of decline in lung function in smokers.Thorax2001; 56 (11): 863-866

16 Levy H, Murphy A, Zou F,et al. IL1B polymorphisms modulate cystic f brosis lung disease.Pediatr Pulmonol2009; 44 (6): 580-593

17 Labenski H, Hedtfeld S, Becker T,et al. Initial interrogation, conf rmation and f ne mapping of modifying genes: STAT3, IL1B and IFNGR1 determine cystic f brosis disease manifestation.Eur J Hum Genet2011; 19 (12): 1281-1288

18 Kim JH, Kwon HJ, Jang YJ. Effects of rhinovirus infection on the expression and function of cystic f brosis transmembrane conductance regulator and epithelial sodium channel in human nasal mucosa.Ann Allergy Asthma Immunol2012; 108(3): 182-187

19 Brouillard F, Bouthier M, Leclerc T,et al. NF-kappa B mediates up-regulation of CFTR gene expression in Calu-3 cells by interleukin-1beta.J Biol Chem2001; 276 (12): 9486-9491

（2014-03-28收稿）

Association ofSCNN1GandIL1Bpolymorphisms with congenital bilateral absence of the vas deferens in the Chinese Han population*

Peng Yuwan1,2, Cheng Longfei3, He Xiaojin1, Yang Xiaoyu4, Wang Jing3,
Wei Zhaolian1, Zhou Ping1, Song Bing1, Wang Binbin3, Ma Xu3**, Cao Yunxia1**1. Reproductive Medicine Center, Department of Obstetrics and Gynecology, the First Aff liated Hospital of Anhui Medical
University, Hefei 230032, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, the First People's Hospital of Hefei; 3. National Research Institute for Family Planning; 4. Reproductive Medical Center of Jiangsu Province People's Hospital

Ma Xu, E-mail: ADgenetics@gmail.com; Cao YunXia, E-mail: caoyunxia6@126.com

ObjectiveTo investigate whetherSCNN1GandIL-1βpolymorphisms were associated with the development of congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD).MethodsA total of 222 Han Chinese males, including 109 CBAVD and 103 controls were recruited in the study.IL-1B(rs3917356) and sodium channel nonvoltage-gated 1 (SCNN1G, encoding the ENaC γ-subunit) (rs5735) polymorphisms were analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and direct sequencing.ResultsNo signif cant differences in gene locus frequency of either SNP were found between patients with CBAVD and the control (P=0.2410,P=0.1701 rs5735;P=0.5564,P=0.0959 rs3917356, respectively).ConclusionThese results suggest that SNPs of SCNNIG gene and IL1B gene may not be associated with the development of CBAVD.

vas deferens/abnormalities; cystic f brosis transmembrane conductance regulator; genes

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.002

R 697.25

資助: 安徽高校省級(jí)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（KJ2011Z166）

**共同通訊作者, 馬旭,E-mail: ADgenetics@gmail.com; 曹云霞, E-mail: caoyunxia6@126.com