辣椒疫霉菌拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及防效測(cè)定

孫冰冰，段紅英，李偉，魏軍，田濤*

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，天津 300381;2.天津市西青區(qū)植物保護(hù)站，天津 300380)

辣椒疫病，是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一種毀滅性的土傳病害，在全球范圍內(nèi)的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)的露地和保護(hù)地均有發(fā)生［1－2］。我國(guó)自從50年代在江蘇報(bào)道此病的發(fā)生后，其發(fā)生和為害有逐漸加重的趨勢(shì)，常導(dǎo)致植株成片死亡，發(fā)病地塊一般病株率為20%左右，嚴(yán)重的達(dá)到80%以上［3］。目前尚無(wú)對(duì)辣椒疫病有效防治的抗病品種，生產(chǎn)上防治主要是以化學(xué)藥劑為主。但由于長(zhǎng)期大量使用殺菌劑，P.capsici已對(duì)大多數(shù)常用農(nóng)藥品種產(chǎn)生了不同程度的抗藥性［4］。另外，由于土壤吸附和微生物降解作用，使用化學(xué)農(nóng)藥防治辣椒疫病效果不佳。由于該病的循環(huán)周期非常短(僅3～5 d)，病害的傳播速度也非常快。這些原因造成生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的大量、高頻使用，帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問(wèn)題［5］。

由于利用自然界有益微生物防治土傳病害具有安全性和有效性方面所具有的天然優(yōu)勢(shì)，因此利用有益微生物對(duì)辣椒疫病進(jìn)行生物防治成為重要的研究方向。我國(guó)已報(bào)道的生防菌主要有芽孢桿菌、放線菌、木霉、曲霉等［1－3，5－8］。國(guó)外有 Quantum 4000、BIBAB－T、AmniteA－100、Biologic－SC27 等細(xì)菌類(lèi)和真菌類(lèi)生防產(chǎn)品作為殺菌劑或生物肥料注冊(cè)登記［5］。本研究中，利用了單一靶標(biāo)初篩－多靶標(biāo)復(fù)篩－室內(nèi)生測(cè)的篩選體系從來(lái)自全國(guó)多個(gè)地區(qū)的根際土壤中篩選出對(duì)辣椒疫病防病效果達(dá)到70%以上的6個(gè)候選生防菌株，其中TB1340防效達(dá)到82%。結(jié)合16S rRNA基因序列測(cè)序鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，TB1340被初步鑒定為Bacillus sp.。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基及辣椒品種

辣椒疫霉(Phytophtora capsici)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)及瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)為天津市植物保護(hù)研究所植物病害生物防治研究室保存。

LB培養(yǎng)基用于拮抗細(xì)菌的分離培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基用于4種病原菌的培養(yǎng)以及拮抗細(xì)菌的篩選。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基(膠狀幾丁質(zhì) 15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g、瓊脂20 g，定容至1000mL，pH值7.0～7.2)用于幾丁質(zhì)酶的檢測(cè)。纖維素酶培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酵母粉5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，瓊脂20 g，定容至1000mL，pH 值 7.0)用于纖維素酶的檢測(cè)。β－1，3－葡聚糖酶培養(yǎng)基(蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 5 g，剛果紅 0.04g，瓊脂 20 g，定容至 1000mL，pH 值7.0)

供試?yán)苯菲贩N:紅線椒8819(對(duì)辣椒疫病中等抗性)，天津科潤(rùn)種業(yè)有限公司提供。

1.2 拮抗細(xì)菌的分離、純化與保存

從天津、河北、山東、山西、福建、河南及江蘇等全國(guó)多個(gè)地區(qū)采集土樣56份(選取植物根圍1～2 mm土壤)，采用土壤稀釋法于LB培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)細(xì)菌，選擇合適的稀釋濃度(每個(gè)平皿出現(xiàn)大約200個(gè)菌落)。從每個(gè)平皿上選擇10個(gè)左右菌落形態(tài)有差異的菌株經(jīng)平板劃線純化，轉(zhuǎn)移到加20%甘油的EP管里面，－20℃保存。

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙法，用直徑7 mm的打孔器取生長(zhǎng)旺盛的病原菌菌餅轉(zhuǎn)接于PDA平板中央，視病原真菌生長(zhǎng)速度選擇合適時(shí)期接種分離到的細(xì)菌(腐霉和立枯絲核菌與細(xì)菌同時(shí)接種，疫霉和灰霉待菌絲擴(kuò)增1 cm后再接種待測(cè)細(xì)菌)。接種時(shí)用高溫滅菌的牙簽蘸取分離到的細(xì)菌，等距離(距離病原菌3 cm處)對(duì)稱(chēng)點(diǎn)接到PDA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照皿中真菌菌絲即將長(zhǎng)滿皿時(shí)測(cè)量抑菌圈大小，根據(jù)抑菌圈大小篩選出對(duì)病原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株。

1.4 室內(nèi)防治效果測(cè)定

選擇大小均勻的辣椒種子經(jīng)消毒后，用滅菌水浸泡4 h，于28℃催芽播種至露白。然后用含有1.0×108cfu/mL待測(cè)菌懸液浸種45 min。將4粒種子放入裝有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽里，待幼苗長(zhǎng)至3～4葉期時(shí)留兩株長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗，每個(gè)處理20盆，3次重復(fù)。將病原菌P.capsici用CA培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)10 d后，誘導(dǎo)出游動(dòng)孢子，用無(wú)菌水將游動(dòng)孢子濃度調(diào)整為1.0×105cfu/mL。在距離植株3 cm處將5mL游動(dòng)孢子懸浮液注入植株根部。置于28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于7、14、21 d后調(diào)查植株萎蔫或死苗情況(病株數(shù))［9］。

1.5 菌株生物學(xué)特性測(cè)定

幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè):將待測(cè)菌株接種在含有膠體幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基［10］上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，在4℃放置7 d后檢測(cè)菌落邊緣形成的透明圈寬度。纖維素酶活性檢測(cè):將待測(cè)菌株接種在含有羧甲基纖維素鈉的纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基［11］上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后經(jīng)染色處理，觀測(cè)在菌落邊緣是否形成透明圈及其寬度。β－1，3－葡聚糖酶活性檢測(cè):將待測(cè)菌株接種在含有剛果紅的葡聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基［12］上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后，觀察菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基顏色變化。

1.6 菌株分類(lèi)地位的16S rRNA序列測(cè)定

按常規(guī)小量細(xì)菌基因組提取方法提取制備樣品［13］，根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物:16sF－AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT 和 16sR－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC。 把 用PCR擴(kuò)增得到的片段連接到 pUC－T載體(康為世紀(jì))，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送金唯智生物科技公司進(jìn)行序列測(cè)定。將得到的序列與其他細(xì)菌來(lái)源的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)(MEGA)，分析其親緣關(guān)系。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用DPS軟件中的Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的分離與初步篩選

依照材料與方法所述，從來(lái)源于全國(guó)各地的56份樣品中分離菌株，建成庫(kù)容為10000株的菌株資源庫(kù)。以P.capsici為靶標(biāo)進(jìn)行平板拮抗實(shí)驗(yàn)，初步得到802株對(duì)P.capsici具有拮抗作用的生防菌候選菌株，其抑菌圈寬度為2～16 mm。用初篩得到的菌株對(duì)R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)，得到62株對(duì)4種病原真菌均具有較好拮抗作用或?qū)?種具有很強(qiáng)拮抗作用的候選生防菌株(表1)，命名為 TB－1301 ～TB－1362。

表1 候選生防菌株對(duì)4種植物病原真菌的拮抗能力測(cè)定Table 1 Antagonistic capability determination of biocontrol candidates against four kinds of phytopathogenic fungi

續(xù)表1

2.2 室內(nèi)盆栽測(cè)定對(duì)辣椒疫病防治效果

從62株候選生防菌中挑選出對(duì)4種病原菌均具有良好拮抗效果的29個(gè)菌株進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，以測(cè)定其對(duì)辣椒疫病的防治效果。在接種病原菌后7、14和21 d調(diào)查植株發(fā)病情況，結(jié)果表明在既不接種病原菌也不接種生防菌的處理中(CK1)，沒(méi)有植株發(fā)病;在只接病原菌，不接種生防菌的處理中(CK2)，植株全部發(fā)病;在同時(shí)接種病原菌和生防菌的各個(gè)處理與CK2相比，其發(fā)病率均在不同程度表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，在21 d后菌株TB1307、TB1308、TB1314、TB1340、TB1344和TB1358相對(duì)防治效率仍達(dá)到70%以上，其中菌株TB1340防效最好，在接種病原菌后7、14和21 d調(diào)查，其相對(duì)防效分別為100%、90%和82%(表2)。

表2 拮抗菌株對(duì)辣椒疫病盆栽的防治效果Table 2 Control effects of antagonistic strain against pepper phytophthora blight in pot experiment

續(xù)表2

2.3 菌株TB1340基本生物學(xué)特性

菌株TB1340在LB固體培養(yǎng)基上經(jīng)37℃培養(yǎng)16 h后，經(jīng)肉眼觀察其菌落為圓形，中間稍微隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，呈白色半透明狀(圖1A);將菌株TB1340接種在含有膠體幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，在4℃放置7 d后在菌落邊緣形成寬度約3 mm的透明圈(圖1B);將菌株TB1340接種在含有羧甲基纖維素鈉的纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后經(jīng)染色處理，在菌落邊緣觀測(cè)到寬度約20mm的透明圈(圖1C);將菌株TB1340接種在含有剛果紅的葡聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后，在菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基顏色明顯變淺(圖1D);

圖1 菌株TB1340基本生物學(xué)特性Fig.1 The basic biological characteristics of strain TB1340

2.4 菌株TB1340種屬16S rRNA基因序列測(cè)定

將菌株TB1340提取基因組DNA后，擴(kuò)增其16S rRNA基因序列，測(cè)序并將TB1340的16S rRNA基因序列上傳 GenBank，其 GenBank登錄號(hào)為 KJ501094。序列比對(duì)分析表明，該菌和解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens菌株Hk8－20以及枯草芽孢桿菌B.subtilis菌株CZB13同源性最高，達(dá)到97.89%。另外，與菌株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus相比其同源性也達(dá)到97.08%。將菌株TB1340的16S rRNA基因序列與高同源性的B.amyloliquefaciens、B.subtilis的序列以及花域芽孢桿菌B.vallismortis、魯菲不動(dòng)桿菌Acinetobacter lwoffii、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等菌株的序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。菌株TB1340與12株B.amyloliquefaciens、3株 B.subtilis及2株B.methylotrophicus聚在一起形成1個(gè)分支。結(jié)合菌株TB1340的16S rRNA基因序列測(cè)定和其形態(tài)特征(圖1A)，將其確定為Bacillus sp.，但最終分類(lèi)地位仍需進(jìn)一步生理生化驗(yàn)證。

圖2 菌株TB1340的16S rRNA區(qū)域的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of 16S rRNA area of strain TB1340

3 討論

我國(guó)幅員遼闊，不同的地方氣候條件和地形地貌差異較大，造就了豐富的微生物資源。如何更好地開(kāi)發(fā)和利用自然界中的有益微生物防治植物病害是一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。為了更為高效地篩選植物病害生物防治菌株，科研工作者進(jìn)行了多種嘗試。有研究者利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)手段建立高通量的篩選體系［14－16］;有研究者采取從沙漠、高原、極地和灘涂篩選生防菌株的策略［2，11，16］。在本研究中，為了發(fā)掘我國(guó)的微生物資源，并且從微生物和植物互作的角度考慮，采用了從多個(gè)省份選取長(zhǎng)勢(shì)較好的農(nóng)作物根圍分離和篩選生防菌株的策略，建立了庫(kù)容為10000株的微生物資源庫(kù)。以P.capsici為靶標(biāo)，利用平板拮抗的方法從中篩選出802株對(duì)P.capsici具有較好拮抗效果的菌株。

與化學(xué)藥劑相比，植病生防產(chǎn)品在防治范圍上較窄，這是影響植物病害生物防治產(chǎn)品推廣的一個(gè)限制性因素。為了盡可能地獲得較為廣譜的候選生防菌株，同時(shí)出于減少在防病效果生物學(xué)測(cè)定的工作量考慮，又以R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum為靶標(biāo)對(duì)候選生防菌株的拮抗能力進(jìn)行檢測(cè)，確定了62株對(duì)4種病原真菌具有較強(qiáng)拮抗能力或?qū)?種真菌具有很強(qiáng)拮抗能力的菌株。經(jīng)溫室盆栽實(shí)驗(yàn)測(cè)定，有6株候選菌株防效達(dá)到70%以上，其中TB1340菌株防效達(dá)到82%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但是其田間使用效果以及對(duì)其他病害的防治效果尚需進(jìn)一步地驗(yàn)證。

生防菌所產(chǎn)生的抗生素類(lèi)、脂肽類(lèi)、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶等物質(zhì)是其抑菌和防病的關(guān)鍵因子［10，17］，幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和 β－1，3 葡聚糖酶是多種芽孢桿菌類(lèi)生防菌株的關(guān)鍵生防因子［10，12］。用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶鑒別培養(yǎng)基檢測(cè)菌株TB1340產(chǎn)酶情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生這3種酶的能力都比較強(qiáng)(圖1)。將菌株TB1340產(chǎn)酶能力和其廣譜的抑菌能力相聯(lián)系，我們進(jìn)一步思考:(1)如何將幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶作為指標(biāo)，納入科學(xué)的篩選評(píng)價(jià)體系從而提高生防菌的篩選效率;(2)這3種酶對(duì)菌株TB1340針對(duì)不同的病原真菌的拮抗和生防能力的貢獻(xiàn)是否相同，如果不同，這種差異具有怎樣的普遍規(guī)律。這些有待于進(jìn)行更加深入地研究。

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