高速逆流色譜(鹽溶液體系)分離制備白芍中的芍藥苷

劉浩，杭偉，周曉晶，陳義倫，王曉，段文娟*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018;2.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;3.北京理化分析測試中心，北京 100089)

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效。用于血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛和頭痛眩暈等癥狀［1］。芍藥苷是白芍中的主要活性成分，具有抗炎、止痛、抗風(fēng)濕、保護肝臟等功效，且具有一定的抗癌作用［2－3］。臨床上芍藥苷制劑被廣泛地應(yīng)用于治療心腦血管、肢節(jié)痛疼等疾病。

目前報道的芍藥苷的制備主要采用大孔樹脂、硅膠柱色譜和高效液相色譜等方法［4－6］，但這些方法存在耗時長、溶劑消耗大、容易造成樣品的不可逆吸附、變性及樣品回收率低等缺點，利用傳統(tǒng)分離方法，不能對其進行快速有效的分離。因此，建立一種快速分離制備芍藥苷的方法非常必要。

高速逆流色譜技術(shù)是一種建立在特殊的流體動力學(xué)平衡基礎(chǔ)上的液－液分配色譜技術(shù)，不會出現(xiàn)固態(tài)支撐材料對樣品和分離結(jié)果的不可逆吸附、干擾、污染、失活及變性等不良影響。而且，因為分離柱內(nèi)沒有固態(tài)填料占體積，容易實現(xiàn)較大的進樣量和制備量;不含價格不菲的填料，所以制備的成本低［7－8］。常用于高速逆流色譜的溶劑體系為氯仿－甲醇－水、石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水以及正丁醇－水等，這些溶劑體系適用于分離純化中等極性的化合物，對于一些高極性的糖苷類成分，很難達到理想的分離效果。本文將鹽水體系應(yīng)用于高速逆流色譜技術(shù)，對白芍中的芍藥苷進行分離、純化，建立了一種快捷、簡單的芍藥苷制備方法，為高極性化合物的分離純化提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器

GS10A型高速逆流色譜儀(北京艾美林科技有限公司)、TBP泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3 mm，分離體積300mL，β值為0.5～0.8)、8823B－紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)、3057－11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司);Waters 600－996高效液相色譜系統(tǒng) (Waters－600溶劑輸送泵，Water－996二極管陣列檢測器，Empower工作站，美國Waters公司)。Varian INOVA－600核磁共振波譜儀 (美國Varian公司);Agilent 1100 Series 6320 ion－trap質(zhì)譜儀 (美國Agilent公司)。

1.2 試劑與材料

粗提物的制備及HSCCC分離用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和硫酸鈉等試劑均為分析純;高效液相色譜用甲醇為色譜純(美國天地公司)，水為過濾蒸餾水。

白芍藥材購自山東省中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院，經(jīng)山東省中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為毛茛科植物芍藥的根。

1.3 溶液的配置

分別稱取30 g和50 g Na2SO4，于室溫下溶于1000mL純水中，超聲使Na2SO4完全溶解。KH2PO4同樣按上述方法配制濃度為5%的溶液。

1.4 芍藥苷粗品的制備

取白芍藥材500 g，加入8倍量75%的乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏112.65 g，加2 L水混懸后，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯分別萃取3次，水相減壓濃縮得芍藥苷粗提物81.47 g，供高速逆流色譜分離用。

1.5 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實驗所用的溶劑體系為正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4溶液(4:1:5，V/V)，按比例配置2 L于分液漏斗中，劇烈振蕩使充分混合，于室溫靜置分層。分出上下相，使用前超聲脫氣15 min備用。

取芍藥苷粗提物100mg，加入上下相各2 mL，振蕩使其完全溶解，用于HSCCC分離。

1.6 分配系數(shù)(KD)的測定

分配系數(shù)的測定按文獻［9－10］中的方法，分別量取已經(jīng)平衡好的溶劑體系中2 mL上相和2 mL下相置于試管中，加入少量芍藥苷粗提物，充分振搖，靜置分層，分別取20 μL上、下相的溶液，用HPLC進行檢測。以上相組分峰面積(AU)與下相組分峰面積(AL)的比值來計算樣品在該溶劑體系中的分配系數(shù)KD。

1.7 HSCCC法分離制備過程

將已超聲脫氣的上相(固定相)以20mL/min流速泵入HSCCC螺旋管中，待上相充滿整個螺旋管，打開主機，使高速逆流色譜儀螺旋管柱按照順時針的方向旋轉(zhuǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達到800 r/min時，以2.0mL/min流速將下相(流動相)泵入高速逆流色譜儀，待流出的上相體恒定后即平衡完畢，進樣，紫外檢測波長為254 nm，根據(jù)記錄信號的出峰情況分別收集流出液。收集的溶液通過HPLC檢測，合并目標成分。

1.8 HPLC 分析條件

色譜柱:Intersil ODS－SP(4.6 mm ×250mm，5 μm);流動相:A 為甲醇，B 為0.2%冰乙酸溶液。梯度洗脫程序為0～20min，5% ～100%A;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC分離條件的優(yōu)化

逆流色譜作為分配色譜，樣品分離的必要條件是選擇適合目標成分的溶劑系統(tǒng)，溶劑系統(tǒng)的選擇可通過測定分配系數(shù)KD來確定。在HSCCC分離過程中，最合適的KD值范圍是0.5～2。若KD＜0.5，出峰時間太快，組分峰之間的分離度較差，達不到分離目的。當(dāng)KD＞2時，出峰時間較長，且峰形變寬，分離效率太低。而當(dāng)0.5＜KD＜2時，目標成分通?？梢栽诤线m的時間出峰，并能得到較好的分離效果［11］。

應(yīng)用高速逆流色譜分離高極性化合物通常采用的溶劑體系為正丁醇-水體系［12］。但是，當(dāng)目標化合物的極性過高時，即使采用正丁醇-水體系也很難達到滿意的分離效果，這是由于化合物極性高，在兩相溶劑的分配中主要在下相，KD值偏小，分離效果差。當(dāng)在水相中添加適量的無機鹽時，由于無機鹽改變水溶液的離子強度，使目標化合物在有機相中的溶解度增大，提高KD值，從而達到理想的分離效果。本實驗測定了目標化合物在乙酸乙酯－正丁醇－Na2SO4和乙酸乙酯－正丁醇－KH2PO4溶劑體系中的KD值，結(jié)果見表1。當(dāng)采用正丁醇－乙酸乙酯－5%KH2PO4(4:1:5，V/V)為兩相體系時，KD值為0.25，小于0.5，目標化合物與雜質(zhì)一起被洗脫出來，無法達到理想的分離效果。改變鹽的種類，將KH2PO4換成Na2SO4。若采用正丁醇－乙酸乙酯－3%Na2SO4(3:2:5，V/V)為兩相容積體系時，KD值為0.17，小于0.5，也無法達到理想的分離效果。通過降低橋溶劑的比例，將體系改為正丁醇－乙酸乙酯－3%Na2SO4(4:1:5，V/V)，KD值增加到0.47，但是，分離效果還是較差，無法得到高純度的目標化合物。調(diào)整Na2SO4的濃度，增大下相中的離子強度，增加目標化合物在上相中的分配，KD值為0.61，在0.5～2的范圍內(nèi)，適合HSCCC分離。故采用正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4為HSCCC分離芍藥苷的溶劑體系。本實驗還對流動相的流速進行了優(yōu)化，當(dāng)流動相的流速較大時，分離效果差;流速較小時，分離時間過長。最后確定流速為2 mL/min，既節(jié)約時間和溶劑，又能達到良好的分離效果。

表1 樣品在不同溶劑體系中的KD值Table 1 KDin different solvent systems

2.2 HSCCC 分離

以正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4(4:1:5，V/V)為兩相溶劑體系，按照1.5節(jié)所述的方法對芍藥苷粗提物進行分離純化。稱取100mg粗提物于試管中，分別加入2 mL的上、下相，充分振搖后進行HSCCC分離，從100mg待分離樣品中一次性得到56.13 mg化合物I。HSCCC圖見圖1。

圖1 芍藥苷粗提物的高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of the crude extract of paeoniflorin

2.3 HPLC分析條件優(yōu)化及結(jié)果

分別考察了甲醇－水、乙腈－水和甲醇－0.2%乙酸溶液作為流動相時的分離情況，結(jié)果表明，當(dāng)流動相為甲醇－0.2%乙酸溶液時分離效果良好，因此本實驗采用甲醇－0.2%乙酸溶液為流動相。

取適量的芍藥苷粗提物、HSCCC分離后的餾分I，用甲醇(色譜純)溶解并過0.45 μm濾膜后，經(jīng)HPLC分析，圖2為相應(yīng)的HPLC圖。圖2A是芍藥苷粗提物甲醇溶液的HPLC圖，圖2B是HSCCC分離后餾分I的HPLC圖。可見樣品在粗提取后依舊有很多雜質(zhì)，經(jīng)HSCCC分離后，得到了高純度的化合物I。采用面積歸一法，測得化合物I的純度在98%以上。

圖2 HPLC分析色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the samples

2.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合 物 I:ESI－MS(positive)，m/z:503［M+Na］+。1H NMR(600MHz，DMSO－d6)δ:8.04(2H，d，J=7.2 Hz，H－2″，6″)，7.68(1H，t，J=7.2 Hz，H－4″)，7.55(2H，d，J=7.2 Hz，H－3″，5″)，5.35(1H，s，H－9)，4.96(1H，d，J=4.8 Hz，H－1′)，4.41(2H，s，H－8)，3.68(1H，d，J=8 Hz，H－6′)，3.0－3.6(m，HGlc)，2.46(1H，d，J=6 Hz，H－5)，2.38(1H，dd，J=10.6 Hz，H－7β)，2.09(1H，d，J=12 Hz，H－3β)，1.83(1H，d，J=10.6 Hz，H－7α)，1.68(1H，d，J=12 Hz，H－3α)，1.31(3H，s，H－10);13C－NMR(150MHz，DMSO－d6):δ 88.1(C－1)，85.5(C－2)，44.1(C－3)，105.2(C－4)，42.7(C－5)，70.7(C－6)，22.4(C－7)，61.7(C－8)，100.6(C－9)，19.6(C－10)，99.1(C－1′)，73.4(C－2′)，77.3(C－3′)70.4(C－4′)，77.3(C－5′)，61.7(C－6′)，130.1(C－1′′)，129.8(C－2′′)，129.2(C－3′′)，133.9(C－4′′)，129.1(C－5′′)，129.7(C－6′′)，166.2(C－7′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［13］基本一致，因此鑒定其為芍藥苷。

本研究采用正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4體系分離純化芍藥中的芍藥苷，具有簡便、快捷、節(jié)省溶劑以及重現(xiàn)性好等特點。而且與Chen等［14］所做的研究相比，本文通過使用添加無機鹽的高速逆流色譜體系，使芍藥苷HSCCC色譜峰與雜質(zhì)HSCCC色譜峰達到了基線分離，因此極大地提高了芍藥苷與粗提物中其他化學(xué)成分在HSCCC分離過程中的分離度。該研究為芍藥中芍藥苷的分離制備提供了一種新型、實用的方法，并且為高極性化合物的HSCCC分離純化提供了新的思路。

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