灰兜巴多糖的抗氧化活性研究

黃瑩偲，鄧曉婷，李 冰，蔡春生，高永清，鐘南京*

（1.廣東藥學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528458；2.華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

0 前言

大量研究表明，臨床許多疾病與機(jī)體的自由基、活性氧有關(guān)[1].活性氧主要包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)和有機(jī)或無(wú)機(jī)過(guò)氧化物(ROO·)等，有較強(qiáng)的生物活性，機(jī)體過(guò)量的自由基會(huì)引起蛋白質(zhì)變性、多糖降解、DNA 鏈斷裂等[2].灰兜巴（又名閉口袋）是一種生長(zhǎng)在四川峨眉山老茶樹(shù)上的菌科類植物，灰兜巴多糖被認(rèn)為具有降低血糖的重要生理功能[3-5].作者旨在研究經(jīng)過(guò)提取分離純化的灰兜巴多糖組分的抗氧化活性和清除自由基的能力，為進(jìn)一步探索灰兜巴多糖的抗氧化能力與降血糖作用之間的關(guān)系提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰兜巴采購(gòu)自四川省峨眉山；木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma 公司）；DEAE-Cellulose 52 (Whatman 產(chǎn)品) ；鄰苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵、水楊酸等均為分析純.

HH-ZKS 型水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；R-1001N 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HC-3618R 高速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；LGJ-25 型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器：上海青浦滬西儀器廠；HL-2 恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司.

1.2 方法

1.2.1 灰兜巴多糖的提取分離和純化[6-8]

采用水提醇沉法提取灰兜巴多糖，取適量灰兜巴加蒸餾水回流煎煮2 次，每次2 h，合并濾液離心，取上清液減壓濃縮至原來(lái)體積的1/15～1/10，濃縮液加入無(wú)水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%進(jìn)行醇沉，離心后復(fù)溶沉淀物冷凍干燥得灰兜巴粗多糖；然后用木瓜蛋白酶-Sevag 法脫蛋白，配制10 mg/mL 粗多糖溶液，加入木瓜蛋白酶使其終濃度為1%，水浴3 h 酶解，經(jīng)過(guò)Sevag 法反復(fù)處理3 次直至無(wú)明顯沉淀，取上清液得到純化的灰兜巴多糖.用苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量為28.02%.

采用DEAE-52 纖維素柱層析(1.5 cm×40 cm)進(jìn)一步純化，上樣濃度為10 mg/mL，上樣體積5 mL，依次用Tris-HCl 平衡緩沖液、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，用恒流泵控制流速為1.0 mL/min，每10 min 收集一管.用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)各管多糖的含量，收集各洗脫組分，濃縮，透析(24 h)，冷凍干燥后得灰兜巴多糖各組分，并依次記為HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4.

1.2.2 灰兜巴多糖組分的體外抗氧化活性[9-11]

1.2.2.1 O2-·自由基清除能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法，取50 mmol/L（pH 8.2）Tris-HCl 緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入1 mL 不同濃度樣品溶液（0.2～1.0 mg/mL）和0.4 mL 25 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1.0 mL 8 mol/L HCl 終止反應(yīng)，以Tris-HCl 緩沖液（pH 8.2）為參比，在299 nm 處測(cè)吸光度，計(jì)算清除率.空白對(duì)照組以1 mL 蒸餾水代替樣品溶液，陽(yáng)性對(duì)照以相同濃度的抗壞血酸代替樣品溶液.

1.2.2.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

分別取1 mL 不同濃度樣品溶液（0.2～1.0 mg/mL）和2 mL DPPH-乙醇溶液加入試管中，加入1 mL 無(wú)水乙醇使反應(yīng)總體積達(dá)到4 mL，搖勻后25 ℃水浴反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇為參比，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度.空白對(duì)照組以蒸餾水代替樣品溶液，對(duì)照組以無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，陽(yáng)性對(duì)照以相同濃度的抗壞血酸代替樣品溶液.

1.2.2.3 ·OH 清除能力的測(cè)定

樣品組試管中加入l mL 的0.15 mmol/L FeSO4，0.4 mL 的2 mmol/L 水楊酸，0.2 mL 不同濃度（0.2～1.0 mg/mL）的樣品溶液，再加入1 mL 的6 mmol/L H2O2和0.4 mL 蒸餾水.空白組用蒸餾水代替樣品溶液，對(duì)照組用蒸餾水代替水楊酸，以上3組試管放入水浴鍋中37 ℃恒溫1 h 后，取出冷卻，以蒸餾水為參比，在510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 灰兜巴多糖的DEAE-52 洗脫曲線

經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶-Sevag 法脫蛋白的灰兜巴多糖，通過(guò)DEAE-52 纖維素離子交換柱進(jìn)行層析，分別用緩沖液、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫后，根據(jù)峰值得到4 組多糖組分，洗脫曲線見(jiàn)圖1.多糖組分HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4 的回收率分別為20.85%、29.63%、23.25%和12.49%，總的回收率為86.22%，HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4 經(jīng)紫外光譜掃描，在260 nm 及280 nm 處均無(wú)紫外吸收，可認(rèn)為它們是不含蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)的較純的樣品[12].

2.2 灰兜巴多糖及各組分DPPH 自由基清除能力

圖2 是灰兜巴多糖及各組分的DPPH 自由基清除率，可以看出，在所研究的濃度范圍之內(nèi)，灰兜巴多糖及各組分的DPPH 自由基清除率均隨著濃度的增加而增加，其中HDB-4 組分的清除能力最強(qiáng).而其他3 個(gè)組分的DPPH 自由基清除率均低于灰兜巴粗多糖，其中HDB-2 組分的DPPH 自由基清除率最低.

圖1 灰兜巴多糖的DEAE-52 洗脫曲線

圖2 灰兜巴多糖及各組分的DPPH 自由基清除率

2.3 灰兜巴多糖及各組分·OH 自由基清除能力

圖3 是灰兜巴多糖及各組分的·OH 自由基清除率，可以看出，在所研究的濃度范圍之內(nèi)，灰兜巴多糖及各組分的·OH 自由基清除率均隨著濃度的增加而增加，其中HDB-3 和HDB-4 組分的清除能力較強(qiáng).HDB-1 組分與灰兜巴粗多糖的·OH 自由基清除能力相當(dāng)，其中HDB-2 組分的·OH 自由基清除率最低.

圖3 灰兜巴多糖及各組分的·OH 自由基清除率

2.4 灰兜巴多糖及各組分超氧陰離子清除能力

圖4 是灰兜巴多糖及各組分的超氧陰離子清除率，可以看出，在所研究的濃度范圍之內(nèi)，灰兜巴多糖及各組分的超氧陰離子清除率均隨著濃度的增加而增加，其中HDB-3 組分的清除能力最強(qiáng).灰兜巴粗多糖的超氧陰離子清除能力較低.

圖4 灰兜巴多糖及各組分的超氧陰離子清除率

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶-Sevag 法脫蛋白的灰兜巴多糖，通過(guò)DEAE-52 纖維素離子交換柱進(jìn)行層析，得到了4 種較純組分.各組分的活性研究表明，HDB-4 組分的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)，HDB-2 組分的清除率最低；HDB-3 和HDB-4 組分的羥基自由基清除能力較強(qiáng)，HDB-2 組分的清除率最低；HDB-3 組分的超氧陰離子清除能力最強(qiáng)，灰兜巴粗多糖的清除能力較低.各組分的抗氧化活性側(cè)重點(diǎn)有所不同，其機(jī)理目前還不清楚，可能要結(jié)合各組分的分子結(jié)構(gòu)等信息才能作出解釋.

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［12］鄧曉婷，鐘南京，李冰，等.灰兜巴的提取分離純化研究［J］.食品科技，2014，已接收.