劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)先天性腎上腺發(fā)育不良基因1與雄激素受體相互作用的研究*

楊麗華 李俞池 王旭亮 石 敏 江智茂 桂耀庭

北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（深圳 518036）

·論 著·

劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)先天性腎上腺發(fā)育不良基因1與雄激素受體相互作用的研究*

楊麗華 李俞池 王旭亮 石 敏 江智茂 桂耀庭**

北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（深圳 518036）

目的劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)-先天性腎上腺發(fā)育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1）和雄激素受體（androgen receptor, AR）在男性生殖系統(tǒng)中均發(fā)揮著不可替代的作用，以往研究證明二者之間存在某些聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)DAX-1和AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用情況。方法構(gòu)建人的帶HA多肽標(biāo)簽的DAX-1真核表達(dá)載體, 以脂質(zhì)體方式將該質(zhì)粒和雄激素受體真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞（COS-7）中，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞提取總蛋白，利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)DAX-1和AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果成功構(gòu)建了人DAX-1真核表達(dá)載體；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DAX-1和AR蛋白在COS-7細(xì)胞內(nèi)可以相互作用。結(jié)論DAX-1與AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能存在相互作用，為后續(xù)研究DAX-1功能、突變致病及DAX-1與AR的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

基因, X連鎖; 受體,雄激素; 男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病

Key woorrddssGenes, X-Linked; receptors, androgen; male urogenital diseases

劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)-先天性腎上腺發(fā)育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1）是轉(zhuǎn)錄因子核受體家族的成員，由470個(gè)氨基酸組成，主要在哺乳動(dòng)物的生殖系統(tǒng)中表達(dá)，如睪丸、卵巢、下丘腦、垂體、腎上腺等[1]。DAX-1 基因敲除的雄性小鼠表現(xiàn)為性腺機(jī)能減退、睪丸發(fā)育異常、生精障礙等[2]。已有研究證明先天性腎上腺發(fā)育不全（adrenal hypoplasia congenital, AHC）和促性腺激素分泌不足的性腺機(jī)能減退（hypogonadotropic hypogonadism, HHG）的發(fā)病與DAX-1突變有關(guān)[3]。雄激素受體（androgen receptor, AR）也是核受體家族中的一員，是一種配體依賴(lài)的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，AR與雄激素結(jié)合形成同源二聚體，進(jìn)入胞核與靶基因的雄激素反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)[4]。AR 基因突變可使其喪失與雄激素的結(jié)合能力，導(dǎo)致男性不育或雄激素不敏感綜合征[5-7]。DAX-1和AR是兩個(gè)緊密相關(guān)的基因，兩者均位于X染色體上，且具有相似的表達(dá)水平，它們編碼的同源蛋白均有一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域。因此，我們推斷DAX-1和AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能存在相互作用。本研究擬構(gòu)建人DAX-1 的真核表達(dá)載體，并與雄激素受體AR共轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞內(nèi)，使用Co-IP技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)兩者間是否存在相互作用，從而為后續(xù)研究 DAX-1功能、突變致病及DAX-1與AR的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞COS-7購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），人睪丸組織的RNA、高保真DNA聚合酶購(gòu)自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，引物合成及DNA測(cè)序于上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成，脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen 公司，人的AR真核表達(dá)載體由美國(guó)喬治惠普癌癥研究中心張傳祥教授惠贈(zèng),哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒購(gòu)自Qiagene公司，AR的抗體購(gòu)自Abcam公司，HA的抗體購(gòu)自sigma公司，ProteinA/G珠子購(gòu)自Millipore公司，DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、移液管等耗材均購(gòu)于Corning公司。

二、方法

（一）人DAX-1基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的獲取

根據(jù) Gene bank 中 DAX-1 的序列用 Prime premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。DAX-1 引物序列∶上游5， CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3，下游5，CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3，分別在上游和下游引物的5，端加上HindⅢ和BamH1酶切位點(diǎn)。將人睪丸組織RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法參照Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物大小。

（二）DAX-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，用HindⅢ-HF和BamH1-HF分別雙酶切PCR產(chǎn)物和帶HA多肽標(biāo)簽的pcDNA3.1(+)，37℃ 4h，對(duì)酶切后的產(chǎn)物分別進(jìn)行柱回收和膠回收，T4 DNA連接酶連接回收后產(chǎn)物，連接體系： pcDNA3.1(+)-3' HA為2μl；回收的DNA片段為6μl；T4 Ligase為1μl；10× Ligation Buffer為1μl，16℃ 8h，取連接產(chǎn)物5ul加入到50ulDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，置于冰上30min，42℃熱擊45s，冰上放置2min，加入600μl不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃搖床培養(yǎng)60min，取200μl涂板(含100μg/mL氨芐青霉素的培養(yǎng)板)，放37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，取陽(yáng)性克隆送測(cè)序。

（三）細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)COS-7細(xì)胞，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，按照無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS-7 細(xì)胞以 3×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，待第2天細(xì)胞貼壁后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000的轉(zhuǎn)染步驟，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-3' HA-DAX1（實(shí)驗(yàn)組，2μg）和pcDNA3.1(+)-3，HA空載（對(duì)照組，2μg）與hAR的表達(dá)載體（2μg）分別共轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞。

（四）細(xì)胞總蛋白的提取

轉(zhuǎn)染48 h后吸棄培養(yǎng)基，根據(jù)Qiagene公司的哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒的提取步驟用1×PBS溶液洗滌2次，加入1ml預(yù)冷的PBS用細(xì)胞刮輕輕刮下，轉(zhuǎn)移到1.5ml的Ep管，450×g，4℃離心5min，棄掉上清置于冰上，用100μl Lysis Buffer（含0.1U Benzonase Nuclease,1μl 100×Protease Inhibitor）重懸沉淀，4℃旋轉(zhuǎn)5min后，14 000×g，4℃離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

（五）免疫共沉淀

將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組提取的蛋白平均分成4分，其中一份作為Input樣品，加入6.25μl的 5×SDS Loading Buffer（含5%1 mM DTT），混勻后98℃處理10 min，-80℃保存。余下3份上清液均加入475μl的Lysis Buffer，補(bǔ)充至每管總體積為500μl，之后分別加入2μg AR抗體，2μg HA抗體，2ug IgG；4℃旋轉(zhuǎn)1h；每管加入20μl ProteinA/G，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。12 000×g，4℃瞬時(shí)離心20s，棄上清；加入600μl Lysis Buffer重懸，12 000×g，4℃離心1min；洗滌Beads，共洗滌3次，棄上清；向Beads中加入15μl的Lysis Buffer和等體積2XSDS上樣緩沖液，混勻后98℃處理10 m in。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量15μl，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（鼠抗人HA 和兔抗人AR單克隆抗體，1∶2000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜孵育及相應(yīng)的二抗（1∶10000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h, ECL 發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，于室溫下自然風(fēng)干，掃描儀掃描結(jié)果保存。

結(jié) 果

一、PPCCRR法獲得DDAAXX--11基因

利用PCR法，成功獲取了約1413 bp的目的片段（圖1）。

圖1 DAX-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

二、重組載體的鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳酶切結(jié)果（圖2）顯示，近1413bp處的條帶為酶切后的目的片段，測(cè)序結(jié)果也顯示該片段為DAX1編碼基因，表明pcDNA3.1(+)-3，HA-DAX1構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均一致。

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-3，HA-DAX1雙酶切結(jié)果

三、蛋白質(zhì)CCoo--IIPP及Western BBlloott檢測(cè)結(jié)果

COS-7細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)入hAR和pcDNA3.1(+)-3，H A-D A X 1表達(dá)質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）以及h A R和pcDNA3.1(+)-3，HA空載（對(duì)照組），轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白，做anti-AR和anti-HA的Co-IP以及anti-AR和anti-HA的Western Blot檢測(cè)蛋白的相互作用和表達(dá)情況，結(jié)果顯示DAX-1和AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能存在相互作用（圖3）。

圖3 Co-IP及Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DAX-1和AR的相互作用

討 論

全球約有10%～15%的育齡夫婦面臨不能生育的問(wèn)題，其中一半是由于男性不育。男性不育發(fā)病因素具有復(fù)雜性和多樣性的特點(diǎn)，包括疾病，營(yíng)養(yǎng)不良，內(nèi)分泌紊亂，基因缺陷和環(huán)境因素等[8]，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但從家族病例報(bào)道和小鼠模型的研究成果中可以推斷遺傳因素起了很大作用[9]。據(jù)估計(jì)，大約有2 000個(gè)不同的基因與男性生育有關(guān)[10]。大多數(shù)基因突變可使青春期發(fā)育受損，隨后由于下丘腦-垂體對(duì)性腺或其基因有重要促進(jìn)作用的因子缺乏，最終引起男性不育。DAX-1和AR即是屬于下丘腦-垂體-性腺軸上的兩個(gè)基因，兩者均位于X染色體上，凡影響功能的基因突變均可引起表型的變化。據(jù)報(bào)道，DAX-1和AR是在男性人群中檢測(cè)到的自然突變率最高的兩個(gè)基因[11]。我們推測(cè)，DAX-1與AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能存在相互作用。

人類(lèi)DAX-1基因位于X染色體p21，于1994年克隆成功[12]。該基因編碼的蛋白由470個(gè)氨基酸組成，是核受體家族的成員，DAX-1蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)垂體促性腺細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)的發(fā)育起非常重要的作用。已有研究證明AHC和 HHG的發(fā)病與DAX-1突變有關(guān)[3]。由于DAX-1 基因位于Xp上的DSS區(qū)，當(dāng)該區(qū)雙拷貝時(shí)常伴有46，XY男性的性反轉(zhuǎn)（女性化），所以起初DAX-1被認(rèn)為是卵巢決定基因。但是，隨后的條件敲除研究結(jié)果表明它在調(diào)節(jié)精子發(fā)生中起重要作用，敲除后的雄性小鼠表現(xiàn)為性腺機(jī)能減退、睪丸發(fā)育異常、生精障礙等[2]。AR是迄今研究最多的與男性不育有關(guān)的基因之一，在哺乳動(dòng)物精子生成中發(fā)揮著重要作用。其編碼的蛋白含有氨基端的DNA結(jié)合域和碳端的雄激素結(jié)合域。46，XY男性由于AR突變可引起完全性雄激素不敏感綜合征(CAIS),表現(xiàn)為女性的原發(fā)性閉經(jīng)[5-7]。AR敲除的小鼠同樣表現(xiàn)出雄激素不敏感及睪丸下降不全癥狀，這類(lèi)小鼠生精受阻,精原細(xì)胞大量死亡導(dǎo)致不育，且該癥狀不能被雄激素藥物補(bǔ)救[13]。

本研究結(jié)果顯示DAX-1和AR蛋白在細(xì)胞內(nèi)可以相互作用，由于兩者在男性生殖系統(tǒng)中均有舉足輕重的地位，由此我們推測(cè)，DAX-1與AR蛋白相互作用的改變可能在男性不育的發(fā)生過(guò)程中至關(guān)重要，DAX-1或AR基因突變可能會(huì)影響兩者的相互作用，進(jìn)而影響下游的靶基因，其具體分子機(jī)制有待深入研究。

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（2013-12-09收稿）

Study on interaction between DAX-1 and AR protein＊

Yang Lihua, Li Yuchi, Wang Xuliang, Shi Min, Jiang Zhimao, Gui Yaoting**
Laboratory of Male Reproductive Medicine，Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China

ObjectiveDAX-1 and AR play irreplaceable roles in male reproductive system, and show some relationship between them. This study is mainly to validate the interaction between DAX-1 and AR protein.MethodsDAX-1 eukaryotic expression vector with HA peptide tag were constructed. The recombined plasmid was sequenced and cotransfected into COS-7 cells by lipofectamineTM2000 with the eukaryotic expression vector of AR. After 48 hours, cells were collected and total protein was extracted.Co-Immunoprecipitation technique was used to detect the interaction between DAX-1 and AR protein.RessuullttssThe eukaryotic expression vector of human DAX1 was constructed successfully. The interaction between DAX-1 and AR was validated by Co-Immunoprecipitation.ConcluussiioonnDAX-1 may interact with AR protein. This study might lay the foundation for further study of DAX-1 function, mutation and the molecular mechanism of its interaction with AR.

∶ Gui Yaoting, E-mail∶ guiyaoting2007@aliyun.com; Tel∶ 0755-83923333-3320

R 697

資助∶ 深圳市科創(chuàng)委項(xiàng)目（編號(hào)：CXB201104220045A），深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201202001，201003076）

**通訊作者, E-mail∶ guiyaoting2007@aliyun.com; Tel∶ 0755-83923333-3320

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.002