不同濃度艾煙干預(yù)12周對大鼠肺與骨骼肌的影響

黃劍 韓麗 林岷瑜 白樺 楊佳 王磊 崔瑩雪 劉鈞天 黃暢 趙百孝

《靈樞·官能篇》載有“針所不為，灸之所宜”，艾灸療法具有數(shù)千年的歷史，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的主流療法之一，具有廣泛的適應(yīng)證和確切的治療效果。但艾灸過程中產(chǎn)生一定的煙霧，針灸從業(yè)人員和患者常暴露于艾燃燒產(chǎn)生的煙霧中，時有眼睛流淚、咽喉不適等反應(yīng)［1］，大量長期吸入艾煙可能對機體有害［2］，嚴重影響艾灸的應(yīng)用與推廣。研究顯示，艾灸導(dǎo)致診室內(nèi)可吸入顆粒物(particles with an aerodynamic diameter of less than 10 μm，PM10)濃度升高，超出國家空氣質(zhì)量標準［3］，大氣可吸入顆粒物的增加可導(dǎo)致慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)住院率和死亡率增加、肺功能下降等［4-5］。

香煙燃燒亦產(chǎn)生一定煙霧，主動吸煙與被動吸煙嚴重危害人體健康。大量流行病學(xué)調(diào)查表明，吸煙是COPD 最重要的發(fā)病因素，香煙中的毒性成分和外源性活性氧(reactive oxygen species，ROS)可直接誘導(dǎo)肺內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。細胞凋亡、氧化損傷和炎癥反應(yīng)三者互為因果，形成閉環(huán)鏈式反應(yīng)，導(dǎo)致COPD 的發(fā)生［6］，并伴隨骨骼肌炎癥反應(yīng)和營養(yǎng)不良。

本實驗通過觀察不同濃度艾煙干預(yù)大鼠12 周后對其血清瘦素、膈肌和趾長伸肌腱腫瘤壞死因子-ɑ(tumor necrosis factor，TNF-ɑ))、白介素-8(interleukin-8，IL-8)的變化并觀察肺、骨骼肌病理改變來探討艾煙對大鼠肺、骨骼肌的影響，以期為艾煙的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

3年陳艾條(規(guī)格18 mm ×200 mm ×10 支;南陽漢醫(yī)有限責任公司生產(chǎn))，全自動電子分析天平(河南愛博特科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))，動式染毒柜(產(chǎn)品型號HOPE-MED8050，天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司生產(chǎn))，JY99-ⅢB 型超聲器(寧波新芝科器研究所)，5415R 高速離心機(德國Eppendorf 公司)，Lambdal P40 紫外可見分光光度儀(美國PE 公司)，Multiskan 3 酶標(芬蘭Thermo);光學(xué)顯微鏡(Olympus BH，單位編號NO.060107)。

1.2 實驗動物與分組

本實驗選擇7 周齡雌雄Wistar 大鼠40 只，體重(60±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。許可證號:［SCXK(京)2012-0001］。所有動物均用標準飼料喂養(yǎng)，自由進水;飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22 ℃，采用人工控制照明，保持12 小時光照(8∶00～20∶00)和黑暗(20∶00～次日8∶00)交替循環(huán)，相對濕度為50～60%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按照隨機數(shù)字表法將40 只大鼠隨機分為四組，每組10 只，雌雄各半。空白對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組分別暴露于0 mg/m3、2.5～3.5 mg/m3、8.0～10.0 mg/m3、27.0～29.0 mg/m3艾煙濃度的動態(tài)染毒柜中(折算為0%、0.4%、2%、15%的透光率)，每組在不同濃度組艾煙中暴露12 周，每天200 分鐘，5 次/周，12 周末取材。

1.3 用動式染毒柜進行艾煙干預(yù)

該實驗選用動式染毒柜可精確控制艾煙濃度并維持染毒環(huán)境氧氣、溫度、濕度、壓強的恒定。艾煙濃度用透光率度量，濃度越低，透光率越高。打開染毒柜電源，設(shè)置動式染毒柜各項參數(shù):氧氣為26%、濕度45～63%、溫度20～22 ℃、壓強－70 kp、時間200 分鐘，觀察染毒柜屏幕顯示，待染毒柜內(nèi)艾煙濃度分別達到低、中、高相應(yīng)濃度，打開艙門，迅速放入動物，待儀器顯示干預(yù)時間已到，取出動物;空白對照組放置于染毒柜中，設(shè)置動式染毒柜各項參數(shù)同前，不進行任何干預(yù)。

1.4 取材

1.4.1 血清 沿腹白線剪開腹腔，移開腸胃，分離脂肪，找到脊柱，再沿脊柱找到腹主動脈，將注射器針頭從遠心端向近心端刺入動脈，抽血5 ml。靜置2小時后，3000 rpm 離心10 分鐘，取上層血清，－20 ℃存放，備檢。

1.4.2 膈肌和趾長伸肌腱 沿腹部向上延長正中線切口至大鼠頸部，在膈肌以上橫著剪開胸壁，打開胸腔，滅菌組織剪小心分離大鼠膈肌，放入事先用焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)處理過的凍存管中，液氮凍存。在大鼠右后肢剪開皮膚，滅菌組織剪分離趾長伸肌腱，放入事先用DEPC處理過的凍存管中，液氮凍存。

1.5 病理學(xué)檢查

肺、膈肌和趾長伸肌腱用生理鹽水沖洗干凈后經(jīng)10%中性甲醛固定，酒精系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 檢測指標

瘦素、膈肌和趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)原理定量測定血清瘦素、膈肌和趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。指標均采用均值±標準差(±s)表示，若各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析;若不服從正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗，結(jié)果以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M(Q3－Q1)］表示。P＜0.05 為有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重及外觀行為變化

艾煙染毒大鼠12 周期間，未出現(xiàn)明顯中毒死亡，各組大鼠被毛外觀體征、行為活動、精神狀態(tài)、糞便、食欲等未見明顯毒性改變，未見嘔吐、流涎等耳鼻眼口等異常分泌物。各組雌性大鼠體重均服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析;而各組雄性大鼠體重不服從正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗。統(tǒng)計結(jié)果表明，可以認為第12 周雌雄大鼠體重未見明顯差異(P＞0.05)，見表1。

表1 第12 周大鼠體重比較(g)

2.2 膈肌、趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量比較

各組雌雄大鼠膈肌、趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量均服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析。統(tǒng)計結(jié)果表明，不能認為空白對照組，低、中、高濃度艾煙各組大鼠膈肌、趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量不等(P＞0.05)，見表2。

表2 不同濃度艾煙對大鼠膈肌、趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 的影響(pg/mg，±s)

表2 不同濃度艾煙對大鼠膈肌、趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 的影響(pg/mg，±s)

注:各組總體均數(shù)比較，1aP=0.951，2aP=0.436，1bP=0.706，2bP=0.900，1cP=0.574，2cP=0.528，1dP=0.957，2dP=0.940，P＞0.05

性別與組別 n 膈肌TNF-ɑ 含量a 膈肌IL-8 含量b 趾長伸肌腱TNF-ɑ 含量c 趾長伸肌腱IL-8 含量d雌性1空白對照組 5 22.86±5.11 94.76±29.15 24.79±3.45 74.87±24.53低濃度組 5 22.52±4.69 94.26±21.24 18.82±9.21 80.56±12.74中濃度組 5 22.01±7.66 92.06±23.08 21.90±5.48 82.28±29.32高濃度組 5 20.72±6.97 79.63±17.87 21.89±6.82 80.53±20.01雄性2空白對照組 5 23.25±7.51 85.58±18.54 24.39±3.55 90.99±21.66低濃度組 5 21.71±7.46 85.06±15.91 22.55±6.55 85.52±33.00中濃度組 5 18.86±5.91 77.87±17.91 22.87±5.66 81.50±26.45高濃度組 5 17.02±4.03 84.25±20.46 19.55±4.36 88.14±1 4.81

2.3 血清瘦素含量比較

各組雌雄大鼠血清瘦素含量均服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析。統(tǒng)計結(jié)果表明，不能認為空白對照組，低、中、高濃度艾煙各組大鼠血清瘦素含量不等(P＞0.05)，見表3。

表3 不同濃度艾煙對大鼠血清瘦素的影響(ng/ml，±s)

表3 不同濃度艾煙對大鼠血清瘦素的影響(ng/ml，±s)

注:雌、雄大鼠各組總體均數(shù)比較，P＞0.05;雌性大鼠各組間比較，P=0.735，P＞0.05;雄性大鼠各組間比較，P=0.989，P＞0.05

性別與組別 n 血清瘦素含量雌性空白對照組 5 22.38±1.27低濃度組 5 22.67±4.99中濃度組 5 21.72±5.16高濃度組 5 20.16±2.35雄性空白對照組 5 21.35±2.48低濃度組 5 20.70±4.64中濃度組 5 20.81±4.05高濃度組21.41±4.74 5

2.4 大鼠肺、膈肌、趾長伸肌腱病理組織觀察

空白對照、低、中、高濃度艾煙各組大鼠肺、膈肌、趾長伸肌腱病理組織均無顯著差異。肺組織染色均勻，組織結(jié)構(gòu)清楚，無變性、無壞死，無纖維組織增生;膈肌、趾長伸肌腱為一片狀附有筋膜的橫紋肌，膈肌細胞排列整齊，無腫脹、溶解、空泡樣改變，肌間隙無炎癥細胞浸潤;趾長伸肌腱肌細胞排列整齊，未見變性、壞死，萎縮、溶解等變化，肌間隙無炎癥細胞浸潤，表明艾煙暴露未導(dǎo)致肺、膈肌、趾長伸肌腱病理性改變，見圖1～3。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)檢查(HE 染色，×400)

圖2 大鼠膈肌病理學(xué)檢查(HE 染色，×400)

圖3 大鼠趾長伸肌腱病理學(xué)檢查(HE 染色，×400)

3 討論

前期研究顯示，艾煙與香煙煙霧的化學(xué)成分不同［7-9］，對細胞、各組織器官的影響亦有差異［10-15］。大量流行病學(xué)調(diào)查表明，香煙造成COPD 并伴隨骨骼肌炎癥反應(yīng)和營養(yǎng)不良，采用被動吸煙建立的COPD 動物模型也是目前所有模型中最接近人類的COPD，但未見艾煙造成COPD 并影響骨骼肌的報道。

本實驗率先研究艾煙對大鼠骨骼肌的影響，研究結(jié)果表明，亞急性毒理實驗中艾煙對大鼠肺、膈肌和趾長伸肌腱的病理組織切片、TNF-ɑ、IL-8 以及血清瘦素無明顯的影響。因此，艾煙對大鼠肺和骨骼肌無明顯毒性作用。

在亞急性毒理實驗過程中，觀察雌雄大鼠的外觀體征和行為活動，糞便性狀等均未見明顯毒性改變，艾煙干預(yù)組雄性大鼠體重于第5 周較空白對照組降低，但第12 周體重恢復(fù)提示應(yīng)激反應(yīng)，所以雌雄大鼠體重均未見明顯影響。此外，本實驗選取大鼠體重為指標，觀察艾煙對大鼠全身骨骼肌的變化，能夠更加客觀、整體地反映艾煙對大鼠骨骼肌的影響。

COPD 是一種具有氣流受限為特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，這種改變與氣道炎癥密切相關(guān)，從而導(dǎo)致氣道壁的損害。肺彈性回縮力下降，呼出氣流受限，呼吸肌負擔加重，并伴隨全身性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)［16］。其中骨骼肌是COPD 系統(tǒng)性損傷最主要的受累器官，表現(xiàn)為肌肉功能障礙、萎縮及肌肉中無脂肪組織的減少［17］。嚴重的COPD 患者其肌肉萎縮程度和疾病程度成正相關(guān)，是COPD 死亡的獨立危險因素［18-19］。本實驗選擇膈肌和趾長伸肌腱作為呼吸肌和外周肌的代表，因為膈肌是最主要的呼吸肌，在呼吸過程中所起的作用約占全部呼吸肌的60～80%［20］，而趾長伸肌腱是大鼠肢體遠心端的肌肉，在大鼠活動中活動頻率很高，排除了廢用性萎縮的可能，兩種肌肉的選擇具有良好的代表性。

香煙煙霧導(dǎo)致肺部啟動一系列的炎癥反應(yīng)，使組織中TNF-α、IL-8 等炎癥介質(zhì)的釋放增加，這些炎癥介質(zhì)又進一步活化了炎癥細胞［21-22］。瘦素和COPD 有著密切的關(guān)系，它與COPD 患者的營養(yǎng)不良和炎癥狀態(tài)有關(guān)。瘦素除了參與COPD 的全身性炎癥反應(yīng)外，還參與了氣道局部炎癥反應(yīng)并且影響COPD 的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，是病情評價的重要指標。進一步的相關(guān)分析表明，COPD 患者急性加重期瘦素與TNF-α 的水平有明顯正相關(guān)性［23］。本實驗雌雄大鼠膈肌TNF-ɑ 的P 值有波動，可能與樣本量不足有關(guān)，有待增加大鼠樣本量以做進一步研究。

4 結(jié)論

本次亞急性毒理實驗率先探討艾煙是否會造成COPD 導(dǎo)致骨骼肌炎癥反應(yīng)和營養(yǎng)不良，發(fā)現(xiàn)低、中、高濃度艾煙干預(yù)雌雄大鼠后，血清瘦素、膈肌和趾長伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量與空白對照組無顯著差異，各組肺、膈肌和趾長伸肌腱病理未見顯著改變，表明艾煙未對大鼠骨骼肌造成明顯炎癥和營養(yǎng)不良反應(yīng)，提示艾煙對大鼠骨骼肌無明顯毒性作用。本研究提出新的艾煙毒理實驗和安全性分析的方法、指標，進一步說明艾煙與香煙煙霧的差異性，為艾煙安全性評價提供了實驗數(shù)據(jù)，有效加快灸法的科學(xué)化、現(xiàn)代化和國際化進程。

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