利用柚皮高效發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶的研究

郭小紅，劉艷苓，姜澤東，2，3，李利君，2，3，朱艷冰，2，3，倪輝，2，3，蔡慧農(nóng)，2，3

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

利用柚皮高效發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶的研究

郭小紅1，劉艷苓1，姜澤東1，2，3，李利君1，2，3，朱艷冰1，2，3，倪輝1，2，3，蔡慧農(nóng)1，2，3

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

以棘孢曲霉為菌種，以磷酸氫二銨為氮源固態(tài)發(fā)酵柚皮生產(chǎn)柚苷酶，結(jié)果表明，在以柚皮為碳源和磷酸氫二銨為氮源的發(fā)酵體系中，添加疏松劑和豆餅粉對(duì)柚苷酶發(fā)酵沒(méi)有顯著影響，而磷酸氫二銨添加量和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚苷酶合成具有顯著影響.當(dāng)無(wú)水柚皮粉中磷酸氫二銨和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為32.4%和170.0%時(shí)，有利于提高柚苷酶發(fā)酵活力.在接種量為7.1%、發(fā)酵溫度為30℃的情況下發(fā)酵6 d，柚苷酶比合成速率與棘孢曲霉的生長(zhǎng)速率符合模型Y柚苷酶＝6.2677X-0．0381，其中Y代表柚苷酶的比合成速率，X代表比生長(zhǎng)速率.用Davis法測(cè)得柚苷酶活力為94.61 IU／g，酶發(fā)酵的培養(yǎng)基成本（5×10-5元／IU）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他同類研究，酶的純度遠(yuǎn)高于用豆餅粉為氮源所獲得的酶純度.

柚皮；柚苷酶；固態(tài)發(fā)酵；成本估算；比活力

0 引言

柑橘類水果是世界上最大宗的水果，無(wú)論是種植面積還是產(chǎn)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他種類的水果［1］，它不僅可以鮮食，還是果汁加工的主要原料.柑橘類水果經(jīng)人們食用或加工后約產(chǎn)生40%的副產(chǎn)物，包括果皮和果渣［2］.因此，對(duì)柑橘加工副產(chǎn)物進(jìn)行高值化利用是柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要研究領(lǐng)域.傳統(tǒng)研究表明，柑橘加工副產(chǎn)物可用于提取果膠、膳食纖維、香精油和黃酮等［3］.近年研究表明，柑橘加工副產(chǎn)物也是發(fā)酵食品生產(chǎn)酶制劑的原料，如可以作為果膠酶和纖維素酶的良好原料［4-5］.

柚苷酶（EC 3.2.1.40）是α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的復(fù)合酶，它不僅能將柑橘類水果中具有苦味的柚皮苷水解成柚皮素，達(dá)到脫苦的效果，還可用于改善釀造酒香味以及制備抗生素、鼠李糖和普魯寧等活性物質(zhì)［6-9］，是一種應(yīng)用前景良好的新型酶制劑.相關(guān)研究表明，柑橘果皮中含有豐富的橙皮苷和柚皮苷，能作為柚苷酶的誘導(dǎo)物［10-12］.Puri等［13］發(fā)現(xiàn)，添加柚皮粉可以提高StaphylococcusxylosusMAK2產(chǎn)柚苷酶；Mendoza-Cal等［14］利用橙皮和柚皮作為發(fā)酵底物，優(yōu)選出產(chǎn)柚苷酶的菌株和發(fā)酵條件；王迪等［15］和陳紅等［16］發(fā)現(xiàn)用棘孢曲霉（Aspergillusaculeatus）固態(tài)發(fā)酵柚皮可高產(chǎn)柚苷酶.這些研究結(jié)果表明，作為柚苷酶發(fā)酵生產(chǎn)原料是柑橘加工副產(chǎn)物綜合利用的一種新途徑.

在前期研究［15-16］中，本實(shí)驗(yàn)室分離得到了一株高產(chǎn)柚苷酶的棘孢曲霉菌株，發(fā)現(xiàn)其在柑橘加工副產(chǎn)物中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵可產(chǎn)生大量的柚苷酶.酶發(fā)酵需要大量氮源，相關(guān)研究［13，17］表明，采用豆餅粉、蛋白胨等有機(jī)氮源對(duì)柚苷酶合成具有促進(jìn)作用.但是，有機(jī)氮源含有豐富蛋白質(zhì)，加入到酶發(fā)酵體系中，將大大增加酶分離純化的難度.最近，筆者發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵體系中，用磷酸氫二銨作為氮源也可以高產(chǎn)柚苷酶，與有機(jī)氮源相比，不會(huì)因?yàn)橐腚s蛋白質(zhì)而導(dǎo)致柚苷酶分離純化困難的問(wèn)題.因此，為進(jìn)一步優(yōu)化用磷酸氫二銨作為氮源的柑橘加工副產(chǎn)物固態(tài)發(fā)酵體系，進(jìn)一步提高柚苷酶產(chǎn)量，本研究擬建立一種高產(chǎn)、高純度的柚苷酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，以柚子加工副產(chǎn)物柚皮為研究對(duì)象，對(duì)固水比、疏松劑、磷酸氫二銨和豆餅粉添加量進(jìn)行優(yōu)化，研究酶合成動(dòng)力學(xué)，分析酶生產(chǎn)培養(yǎng)基成本及酶純度，為柚苷酶的高效發(fā)酵及柑橘副產(chǎn)物的高值化利用提供試驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 原料與藥品

原料：柚子外果皮由福建省國(guó)農(nóng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，經(jīng)50℃烘干、粉碎過(guò)40目篩備用.

藥品：柚皮苷和柚皮素（純度均≥98%）購(gòu)于中國(guó)陜西小草植物科技有限責(zé)任公司；甲醇和乙腈（均為色譜純）購(gòu)于美國(guó)TEDIA公司；其他試劑（分析純）均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司.

1.2 菌種與培養(yǎng)基

棘孢曲霉JMUdb058菌株［18］由集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室選育保存.

斜面培養(yǎng)基［19］（g／L）：MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO41.0，（NH4）2SO41.5，KCl0.5，KNO31.5，無(wú)水CaCl20.1，酵母膏2.0，柚皮苷2.69，瓊脂20，初始pH＝6.0，121℃滅菌20 min.

固態(tài)發(fā)酵初始培養(yǎng)基：在柚皮粉（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.4%）中加入磷酸氫二銨10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），并加入與柚皮粉同質(zhì)量的蒸餾水.

1.3 儀器設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜分析儀和Symmetry C18反相柱（4.6 mm×150 mm，3.5μm）購(gòu)于美國(guó)Waters有限公司；SHZ-IIID型循環(huán)水式多用真空泵購(gòu)于上海亞榮生化儀器廠；ALP-高壓蒸汽滅菌器購(gòu)于日本ALP公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)于常州國(guó)華電器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱購(gòu)于上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；pH211C酸度計(jì)購(gòu)于北京哈納科儀科技有限公司；UV-7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于尤尼柯儀器有限公司；101-3B型電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)于上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化及發(fā)酵操作

將4℃下貯藏的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4 d得到成熟孢子，用0.75%（體積分?jǐn)?shù)）無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，轉(zhuǎn)移至裝有50 mL無(wú)菌生理鹽水和無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，將孢子充分打散后，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整其OD600值至2.0（孢子1×108個(gè)／mL），即得孢子懸液.為了優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行以下試驗(yàn)：在250 mL三角瓶中裝入用5 g柚皮粉加入其他成分配成的培養(yǎng)基，滅菌冷卻后按照總裝樣量的7.1%接種上述孢子懸液，攪拌均勻后于30℃靜置培養(yǎng)8 d.

1.4.2 加水量對(duì)柚皮固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

保持發(fā)酵初始培養(yǎng)基的其他成分不變，分別按照柚皮粉與水的質(zhì)量比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶3配制培養(yǎng)基，接種發(fā)酵后，測(cè)定酶活力、生物量以及還原糖含量.

1.4.3 疏松劑對(duì)柚皮固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以柚皮粉與水的質(zhì)量比為1∶1.5的比例混合，分別加入以下3種成分配制培養(yǎng)基：（A）按柚皮粉質(zhì)量的10%添加（NH4）2HPO4；（B）分別按柚皮粉質(zhì)量的10%添加（NH4）2HPO4和麩皮；（C）分別按柚皮粉質(zhì)量的10%添加（NH4）2HPO4和甘蔗渣.其中，A為對(duì)照，B為添加10%麩皮作為疏松劑的培養(yǎng)基，C為添加10%甘蔗渣為疏松劑的培養(yǎng)基.接種發(fā)酵后，分別測(cè)定酶活力、生物量以及還原糖含量.

1.4.4 磷酸氫二銨添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

固定培養(yǎng)基中柚皮粉和水的質(zhì)量比為1∶1.5，分別按照柚皮粉質(zhì)量的0%、10%、20%、30%、40%和50%添加磷酸氫二銨，配制培養(yǎng)基，接種發(fā)酵后，分別測(cè)定酶活力、生物量以及還原糖含量.

1.4.5 豆餅粉添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

固定每份培養(yǎng)基中添加柚皮粉質(zhì)量的30%（NH4）2HPO4，以柚皮粉與水的質(zhì)量比為1∶1.5的比例加水，分別按柚皮粉質(zhì)量的0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%添加豆餅粉，配制培養(yǎng)基，接種發(fā)酵后，分別測(cè)定酶活力、生物量以及還原糖含量.

1.4.6 柚苷酶動(dòng)態(tài)規(guī)律及酶合成動(dòng)力學(xué)

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基（在柚皮粉中加入30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）磷酸氫二銨，并加入柚皮粉質(zhì)量1.5倍的蒸餾水），接種發(fā)酵，每隔2 d取樣一次，分別測(cè)定各樣品的酶活力、生物量及還原糖含量，分析柚苷酶活性、生物量和還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律，計(jì)算比速率，并擬合柚苷酶合成及生長(zhǎng)的關(guān)系動(dòng)力模型.

1.4.7 柚苷酶活力測(cè)定

為了快速獲得優(yōu)化效果，在大部分試驗(yàn)中，參照Ni等［20］的液相色譜法（HPLC）測(cè)定柚苷酶活力.取樣后，在每個(gè)發(fā)酵三角瓶中加入100 mL pH＝5.0的檸檬酸（0.01 mol／L）-磷酸氫二鈉（0.02 mol／L）緩沖液，30℃、200 r／min振蕩浸提1 h，用定性濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)4℃、13000 r／min離心20 min即得粗酶液.取2 mL柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液（300μg／mL）與1.9 mL pH＝5.0緩沖液混合，50℃恒溫保溫15 min，加入0.1 mL粗酶液，50℃反應(yīng)15 min，置于100℃加熱30 min使酶失活，迅速冷卻后過(guò)0.45μm濾膜，用HPLC測(cè)定反應(yīng)液中柚皮苷和柚皮素含量的變化.空白對(duì)照以滅活的酶液代替酶溶液，其他方法條件相同.液相色譜條件為：流動(dòng)相流速0.4 mL／min，柱溫35℃，上樣體積20μL，走樣時(shí)間20 min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，梯度洗脫程序見(jiàn)表1.根據(jù)柚皮素的生產(chǎn)量計(jì)算柚苷酶活力，酶活力單位（IU）定義為：在50℃、pH＝5.0的條件下，每分鐘生成1μmol柚皮素所需柚苷酶的量定義為一個(gè)柚苷酶活力單位.

表1 用于柚苷酶活力檢測(cè)的高效液相色譜流動(dòng)相梯度Tab．1 Mobile phase com position and gradient formeasuring naringinase ac tivity

為了對(duì)比本研究和國(guó)內(nèi)外同類研究的酶產(chǎn)量水平，在驗(yàn)證試驗(yàn)中，除HPLC法外，還參照Puri等［17］用Davis法測(cè)定柚苷酶活力，具體操作是：取0.9 mL 0.05%柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液（pH＝4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液）與100μL粗酶液混合均勻，置于50℃恒溫箱保溫60 min，迅速吸取100μL反應(yīng)液并加入90%一縮二乙二醇5 mL、4 mol／LNaOH溶液100μL，搖勻后于28℃保溫10 min，在420 nm下測(cè)定吸光度值.根據(jù)柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)后消耗的柚皮苷量，以此為依據(jù)計(jì)算柚苷酶活力，每個(gè)柚苷酶活力單位（IU）定義為在此反應(yīng)體系下消耗1μmol柚皮苷所需的柚苷酶量.

1.4.8 生物量測(cè)定

參考魏培蓮等［21］提供的方法測(cè)定氨基葡萄糖含量，用以計(jì)算固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的菌體量.稱取干發(fā)酵樣品0.300 g，加2 mL 60%H2SO4，25℃恒溫箱浸泡24 h，加入28 mL蒸餾水稀釋H2SO4至濃度為1 mol／L，置于250 mL三角瓶中，沸水浴加熱1 h，冷卻后用1 mol／LNaOH中和至pH＝7.0，定容至100 mL.取2 mL樣液加1 mL乙酰丙酮試劑，沸水浴加熱0.5 h，冷卻后加入2 mL無(wú)水乙醇、1 m L對(duì)二氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4 m L無(wú)水乙醇，60℃保溫1 h，測(cè)定OD530，對(duì)照組將樣液替換成水，根據(jù)菌體干重對(duì)氨基葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物量.

1.4.9 還原糖含量測(cè)定

參考張龍翔等［22］的方法，取1 mL粗酶液用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測(cè)定其中還原糖含量.

1.4.10 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參考陳鈞輝等［23］的考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，配制1 g／L的牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分別取0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mL，加入蒸餾水至0.1 mL，再分別加入5 mL配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250，震蕩均勻后放置5 min，測(cè)定595 nm下的吸光度值.取0.1 mL樣品，按上述方法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶液中的蛋白質(zhì)含量.

1.4.11 發(fā)酵產(chǎn)物SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳

分別配制10%分離膠和5%濃縮膠，灌膠，待膠凝固后，取待測(cè)酶液30μL，加入4×SDS上樣緩沖液10μL，混勻，沸水浴處理5 min，迅速冷卻，離心后取12μL上清液加入到加樣孔中，往電泳槽中倒入1×SDS緩沖液，在電流12 mA的條件下電泳120 min后進(jìn)行銀染顯色.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次平行測(cè)定的平均值，應(yīng)用Excel軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，應(yīng)用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）．

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮粉和水的比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，初始含水量是影響發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素之一.據(jù)相關(guān)研究報(bào)道［24］，含水量過(guò)高，不僅會(huì)降低氧的擴(kuò)散和交換，而且稀釋了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而影響菌體生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶；當(dāng)含水量較低時(shí)，培養(yǎng)基中糖濃度較高，導(dǎo)致產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物阻遏并增大了培養(yǎng)基滲透壓，也會(huì)影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶量.

圖1顯示，還原糖含量隨水的比例增加而下降；生物量和柚苷酶活力隨水的比例增加先增加后減少，當(dāng)柚皮粉和水的質(zhì)量比為1∶2.5時(shí)，生物量達(dá)到最大；當(dāng)柚皮粉和水的質(zhì)量比為1∶1.5時(shí)，柚苷酶活力達(dá)到最大.因此，在下面的試驗(yàn)中按柚皮粉和水1∶1.5的質(zhì)量比加水.

2.2 疏松劑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

柚皮中含有大量的果膠［25］，滅菌后容易導(dǎo)致培養(yǎng)基黏度增大及通透性降低而影響微生物生長(zhǎng).甘蔗渣和麩皮含有豐富的纖維素，能增加固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的疏松透氣性，提高菌絲體生長(zhǎng)［26］.在柚子果皮中添加一定量的甘蔗渣和麩皮（增加柚苷酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的通透性）進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果（見(jiàn)圖2）顯示，添加麩皮和甘蔗渣后產(chǎn)酶量下降，生物量和還原糖含量變化不大.進(jìn)一步進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，添加疏松劑后對(duì)產(chǎn)酶量、還原糖、生物量含量均沒(méi)有顯著性影響，出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因是添加疏松劑后培養(yǎng)基總量增加，但柚皮粉在培養(yǎng)基中的含量降低了，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降低與通氣量增加的效應(yīng)相互抵消.針對(duì)該現(xiàn)象，在后續(xù)發(fā)酵中不添加疏松劑.

圖1柚皮粉和水的比例對(duì)柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.1 Effectof citrus peel-water ratio on the solid-state fermentation ofnaringinase

圖2添加疏松劑對(duì)柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.2 Effectof loosening agents on solid-state fermentation ofnaringinase

2.3 磷酸氫二銨對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

前期研究［27］結(jié)果表明，以銨鹽或尿素為氮源，可以消除葡萄糖、果糖和淀粉等對(duì)柚苷酶發(fā)酵的分解代謝阻遏作用，從而提高柚苷酶的發(fā)酵產(chǎn)量.考慮到銨鹽利用后殘留的磷酸鹽可能影響培養(yǎng)基pH值，從而影響柚苷酶的發(fā)酵，因此，研究了磷酸氫二銨的添加量對(duì)柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的影響.結(jié)果如圖3所示，當(dāng)磷酸氫二銨添加量從0增加到10%柚皮粉時(shí)，還原糖迅速降低，生物量大幅度上升，之后還原糖含量隨磷酸氫二銨添加量增大趨于平穩(wěn)，而生物量隨添加量增大而降低.當(dāng)磷酸氫二銨為30%柚皮粉時(shí)，柚苷酶活力達(dá)到最大，之后隨著添加量的增大而減少.該現(xiàn)象可能是由于棘孢曲霉的生長(zhǎng)及酶分泌所需的最適pH值不一致所引起的；當(dāng)磷酸氫二銨添加量為10%柚皮粉時(shí)，其培養(yǎng)基的pH值最適合于微生物生長(zhǎng)，此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量用于生長(zhǎng)菌體，體現(xiàn)出生物量最大，而酶活力不是最大；當(dāng)磷酸氫二銨添加量為30%柚皮粉時(shí)，培養(yǎng)基的pH值最適于酶合成，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量流向酶蛋白合成，體現(xiàn)出生物量減小，而酶合成量最大.由于本研究是以提高柚苷酶產(chǎn)量為試驗(yàn)?zāi)康?，因此后期試?yàn)添加磷酸氫二銨的量為30%柚皮粉.

2.4 豆餅對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

豆餅粉來(lái)源穩(wěn)定，價(jià)格低廉，含有豐富的微量氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是發(fā)酵工業(yè)中常用的氮源及生長(zhǎng)因子.大量添加豆餅粉作為氮源，由于其中淀粉分解（產(chǎn)生葡萄糖）會(huì)對(duì)誘導(dǎo)酶產(chǎn)生阻遏［17，28］，但相關(guān)研究表明豆餅粉是柚苷酶發(fā)酵的良好氮源［13］，但添加豆餅粉會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中雜蛋白質(zhì)含量偏高，影響對(duì)酶進(jìn)行分離純化.本研究采用磷酸氫二銨為氮源配制培養(yǎng)基，并在其中添加不同量豆餅粉進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示，豆餅粉的添加量對(duì)生物量、還原糖含量和柚苷酶活力的影響不明顯（見(jiàn)圖4）.用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，進(jìn)一步證實(shí)了添加豆餅粉對(duì)生物量、還原糖含量和柚苷酶活力均無(wú)顯著性影響.該結(jié)果與相關(guān)研究［13］報(bào)道在培養(yǎng)基中添加豆餅粉可以大幅度提高柚苷酶產(chǎn)量明顯不同，原因主要有：1）磷酸氫二銨和豆餅粉都是柚苷酶發(fā)酵優(yōu)良氮源，在培養(yǎng)基中含有充足磷酸氫二銨的情況下，再補(bǔ)充氮源豆餅粉已經(jīng)沒(méi)有必要；2）柑橘副產(chǎn)物中可能含有豐富的生長(zhǎng)因子，不需要額外補(bǔ)充豆餅粉、蛋白胨等物質(zhì)就能提供棘孢曲霉生長(zhǎng)及其酶合成需要的生長(zhǎng)因子.考慮到本研究柚皮粉含有7.4%的水分，因此優(yōu)化培養(yǎng)基的組成為：在無(wú)水柚皮粉中添加32.4%的磷酸氫二銨和170%的水（此比例均為與無(wú)水柚皮粉的質(zhì)量比）.

圖3磷酸氫二銨添加量對(duì)柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.3 Effectofaddition of(NH4)2HPO4on so lid-state fermentation ofnaringinase

圖4豆餅粉添加量對(duì)柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.4 Effectofaddition ofsoybeanmealon solid-state fermentation ofnaringinase

2.5 柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的動(dòng)態(tài)規(guī)律及酶合成動(dòng)力學(xué)

如圖5a所示，隨發(fā)酵時(shí)間增加，還原糖含量逐漸降低，生物量和酶活性先快速增加后趨于平穩(wěn)；生物量和酶活力曲線變化趨勢(shì)高度一致，發(fā)酵6 d時(shí)，生物量和柚苷酶活性同時(shí)出現(xiàn)最大值.圖5b顯示，比生長(zhǎng)速率X（以菌體干重的含量表征，單位為d-1）和柚苷酶的比合成速率Y（單位為IU／（g·d））隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)同步降低趨勢(shì).進(jìn)一步擬合柚苷酶比合成速率與棘孢曲霉比生長(zhǎng)速率的關(guān)系，得到它們的回歸關(guān)系模型為Y柚苷酶＝6.2677X-0.0381.該模型顯示，棘孢曲霉柚苷酶的合成似乎符合部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型模型，每生長(zhǎng)1 g的菌體就會(huì)合成約6.27 IU的柚苷酶，在菌體生長(zhǎng)停止后，柚苷酶以0.038 IU／（g·d）的速度緩慢下降.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，0.0381僅相當(dāng)于6.2677的0.61%，而圖5a顯示，菌體生物量與酶活力測(cè)定的誤差均在5%左右，該分析結(jié)果說(shuō)明0.0381這個(gè)數(shù)值可能是由于測(cè)量誤差引起，而不是實(shí)際差異引起的，由此推測(cè)該柚苷酶合成屬于生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型.相關(guān)研究［29］表明，產(chǎn)物合成生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型的特征是產(chǎn)物合成曲線與生長(zhǎng)曲線高度一致.圖5中棘孢曲霉生物量和柚苷酶活性曲線隨時(shí)間變化趨勢(shì)的高度一致性也進(jìn)一步證明該柚苷酶合成屬于生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，該結(jié)果與陳紅等［27］用豆餅粉為氮源研究的柚苷酶合成動(dòng)力學(xué)規(guī)律相一致，但與張晨等［29］研究結(jié)論（B04菌株產(chǎn)柚苷酶的合成屬于非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）不一致，其主要原因可能是菌株、發(fā)酵條件及發(fā)酵狀態(tài)不同所致.

圖5柚苷酶合成的動(dòng)態(tài)規(guī)律及酶合成動(dòng)力學(xué)分析Fig.5 Dynam ic process and kine tic analysis ofnaringinase during p roduction

2.6 用柚皮為碳源、磷酸氫二銨為氮源發(fā)酵柚苷酶的成本分析

目前，國(guó)內(nèi)柚苷酶的研究都停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，商品酶制劑在國(guó)內(nèi)沒(méi)有生產(chǎn)，市場(chǎng)上尚屬空白.國(guó)外只有美國(guó)、日本等少數(shù)國(guó)家生產(chǎn)，價(jià)格昂貴，如2009年美國(guó)Sigma公司出品的柚苷酶制劑（酶活力約為300 U／g），價(jià)格為1623.9元／kg，日本田邊制藥生產(chǎn)的柚苷酶制劑（酶活力為150 U／g）售價(jià)高達(dá)2600元／kg，因此限制了柚苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用.本研究柚苷酶活力達(dá)到94.61 IU／g（用Davis法測(cè)定），高于Mendoza-Cal（2.58 U／mL）［14］、張晨等（342 U／mL）［29］報(bào)道的酶活力，同樣高于用王迪［15］和陳紅［16］的方法發(fā)酵所獲得的柚苷酶活力（見(jiàn)表2）.計(jì)算柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基成本，并與各報(bào)道提供的柚苷酶生產(chǎn)培養(yǎng)基成本進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果（見(jiàn)表2）顯示，本研究生產(chǎn)柚苷酶的成本僅為5×10-5元／IU，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)室前期研究［15-16］和國(guó)內(nèi)同類研究［14，29-30］的生產(chǎn)培養(yǎng)基成本.

表2 柚苷酶生產(chǎn)成本估算Tab.2 Cost evaluation for naringinase production

2.7 用柚皮為碳源、磷酸氫二銨為氮源發(fā)酵柚苷酶的純度分析

酶的純度是影響酶工業(yè)化制備及應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，發(fā)酵產(chǎn)物中酶的純度越高，提純應(yīng)用的可能性也越高.由表3可得，添加磷酸氫二銨作為氮源，酶的比活力為16.47 IU／mg，遠(yuǎn)高于以豆餅粉為氮源所獲得的比活力（7.01 IU／mg）.分別浸提以磷酸氫二銨和豆餅粉為氮源獲得的粗酶液，稀釋到相同的酶活性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（見(jiàn)圖6）發(fā)現(xiàn)，以豆餅粉為氮源的發(fā)酵產(chǎn)物中雜蛋白質(zhì)明顯比用磷酸氫二銨為氮源發(fā)酵的粗酶液多.這兩個(gè)結(jié)果說(shuō)明，用磷酸氫二銨為氮源發(fā)酵所獲得的柚苷酶比用豆餅粉為氮源發(fā)酵的柚苷酶的純度高，有利于進(jìn)一步純化利用.

圖6不同粗酶液的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of different crude enzymes

表3 兩種培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)柚苷酶的影響Tab.3 Com parison of two media for the production of naringinase byA．a(chǎn)culeatus

3 結(jié)論

1）初步優(yōu)化獲得以柚皮為碳源，磷酸氫二銨為氮源產(chǎn)柚苷酶的培養(yǎng)基為：在無(wú)水柚皮粉中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)32.4%磷酸氫二銨和170.0%的水.

2）用柚皮為碳源，磷酸氫二銨為氮源培養(yǎng)棘孢曲霉，柚苷酶合成符合模型Y柚苷酶＝6．2677X-0．0381，屬于生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型.

3）用柚皮為碳源，磷酸氫二銨為氮源培養(yǎng)棘孢曲霉，柚苷酶活力與同類研究報(bào)道相當(dāng)，酶發(fā)酵成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他同類研究，酶純度高于用豆餅粉為氮源所獲柚苷酶的純度.

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（責(zé)任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰）

Utilization of Pomelo Peel for Effective Production of Naringinase During Solid-state Fermentation

GUO Xiao-hong1，LIU Yan-ling1，JIANG Ze-dong1，2，3，LILi-jun1，2，3，
ZHU Yan-bing1，2，3，NIHui1，2，3，CAIHui-nong1，2，3
（1.College of Food and Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China；
2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering，Xiamen 361021，China；
3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City，Xiamen 361021，China）

The naringinase production fromAspergillusaculeatuswas investigated using（NH4）2HPO4as nitrogen source in pomelo peel fermentation.The results showed thatnaringinase activity did not significantly increase by adding loosening agents and soybean meal powder，while the content of diammonium hydrogen phosphate and water had significant influence on naringinase production.The composition of the optimalmedium included anhydrous citrus peel powder，the percentage rates for other ingredients in anhydrous citrus peel powder were as follow：diammonium hydrogen phosphate，32.4%；water，170.0%.By using the fermentation condition of inoculum size7.1%and fermentation temperature 30℃，the naringinase fermentation was estimated to have a naringinase synthesismodelYnaringinase＝6.2677X-0．0381，whereYrepresented the enzymatic specific synthetic rate andXwas the specific growth rate.After fermentation for 6 days，naringinase activity attained 94.61 IU／g by Davismethod analysis，higher than most research before reported.In addi-tion，themedium cost wasmerely 5×10-5Yuan／IU naringinase，much lower than those previous studies. Furthermore，the enzyme extract revealed higher purity than that in our previous study.

pomelo peel；naringinase；solid-state fermentation；cost estimation；specific activity

S 216.2

A

1007-7405（2015）05-0356-09

2015-02-10

2015-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271914）；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011J01225）；集美大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目（2010A006）

郭小紅（1990—），女，碩士生，從事食品生物技術(shù)研究.通信作者：蔡慧農(nóng)（1957—），男，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究，E-mail：huinongcai＠sina.com.cn.