中藥灌腸對5/6腎切除大鼠腎衰竭模型微炎癥狀態(tài)的影響*

姜 晨，王佳麗，宮欣茹，張 琳，翟建新，楊洪濤

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

中藥灌腸對5/6腎切除大鼠腎衰竭模型微炎癥狀態(tài)的影響*

姜 晨1，王佳麗2，宮欣茹1，張 琳1，翟建新1，楊洪濤1

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

[目的]觀察中藥灌腸改善慢腎衰模型大鼠的微炎癥狀態(tài)情況，探討其機制。[方法]將44只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、灌腸方組和辛伐他汀組，除正除對照組外均行5/6腎切除術制作CRF動物模型。造模后各組開始灌胃或灌腸給藥6周。分別于造模后1、3、6周取血檢測大鼠的血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Toll樣受4（TLR4）等變化情況。實驗結束后觀察腎臟和小腸組織形態(tài)學的改變。[結果]灌腸方組大鼠的微炎癥指標CRP、TNF-α濃度與辛伐他汀組沒有統(tǒng)計學差異，說明灌腸方在改善微炎癥狀態(tài)中也有類似于他汀類藥物的作用，其機制可能與阻斷TLR4表達有關。腎臟病理結果顯示灌腸治療對腎間質纖維化有一定的改善作用。[結論]中藥灌腸能改善CRF大鼠生存狀態(tài)，延緩病情進展，對腎間質纖維化有一定的積極作用。其作用機制可能是通過降低炎癥因子表達，改善微炎癥狀態(tài)有關，其作用與辛伐他汀類似。

5/6腎切除；慢腎衰；微炎癥狀態(tài)；中藥灌腸；辛伐他汀

“微炎癥狀態(tài)”在慢性腎功能衰竭（CRF）進程中十分普遍，這種以炎癥因子、急性反應蛋白輕度持續(xù)升高為特點的微炎癥狀態(tài)可加重CRF患者腎功能惡化程度，而且促進動脈粥樣硬化（AS）、營養(yǎng)不良、貧血等并發(fā)癥的發(fā)生，影響患者死亡率及臨床預后[1-2]。在針對微炎癥狀態(tài)的中醫(yī)治療中，灌腸療法及中藥湯劑的運用發(fā)揮了多靶點治療的突出作用，已有研究證明[3]中藥能改善CKD炎癥反應，其機制可能與調節(jié)脂質代謝和改善細胞免疫功能有關。天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎病科開展結腸透析并運用灌腸方中高位保留治療慢性腎衰竭，能有效改善尿毒癥患者的臨床癥狀，延緩腎功能損害的進程。為證實該法對“微炎癥狀態(tài)”的干預作用，筆者通過5/6腎切除大鼠腎衰竭模型，評價中藥灌腸在改善CRF大鼠“微炎癥狀態(tài)”方面的作用并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性大鼠，體質量（200± 20）g。購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 藥物 灌腸方中藥物（大黃30 g，蒲公英30 g，生牡蠣30 g）購自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院煎藥室制備。辛伐他汀片：杭州默沙東制藥有限公司，批號130168。

1.3 儀器與試劑 BAll0S型電子天平（德國Sartorius公司）、TGL－16G低溫臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠制造）、全自動生化分析儀（日本日立70209全自動生化分析儀）、Elisa的儀器：（450±10）nm濾光片的酶標儀、單道或多道微量加液器及吸頭、稀釋樣品的EP管等。C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Toll樣受體4（TLR4）試劑盒：購自武漢優(yōu)爾生科技股份公司。血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、TG試劑盒均購自北京中生北控生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分組 CRF大鼠于造模成功后隨機分為3組：1）模型組。2）灌腸方組。3）辛伐他汀組，每組12只。4）正常對照組（即假手術組）8只。

2.2 造模 大鼠適應性喂養(yǎng)3天后，依據(jù)Platt法即5/6腎切除術并按照最新的文獻記載[4]制備CRF大鼠模型。各組大鼠均以10%水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒術后做背部正中直行切口，使用大鼠開口器以暴露背闊肌及腹外斜肌顯現(xiàn)腰下三角，經此三角向上切開背闊肌，向下切開腹外斜肌，并于腰上三角處切開腰背筋膜，拉開切口，充分暴露左腎。除假手術組外，其余各組均切除左腎上下兩極約2/3，明膠海綿止血后，復位腎臟，縫合。1周后性第2次手術，結扎腎蒂，切除右腎。待創(chuàng)面凝固后，切口處放入少量磺胺粉，分別用0號、4號絲線逐層間斷縫合。術后常規(guī)注射青霉素（80 kU/只）×3 d。分別于手術后第1、3周取血測定各造模組大鼠SCr、BUN水平，以SCr水平顯著高于正常對照組為造模成功，建立CRF大鼠模型。造模前后各組大鼠SCr水平見圖1。

圖1 造模前后各組大鼠Scr水平Fig.1 The levels of Scr in rats of each group after model establishment

2.3 給藥 從造模成功后第2周開始給藥處理，1）組給予蒸餾水2 mL灌胃。2）組給予灌腸方濃煎劑2 mL，30℃左右，懸尾倒立保留灌腸1min。3）組給予辛伐他汀[5]生藥2 mL灌胃。上述各組灌藥1次/天，連續(xù)給藥6周。正常對照組不進行任何處理，以上各組均用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水中藥灌腸方和辛伐他汀片的用量按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比值表”計算，每次灌胃前新鮮配制。

2.4 取材與檢驗方法

2.4.1 取材 實驗結束時（給藥6周后）大鼠隔夜空腹，測量體重，以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定大鼠暴露腹部，剪開腹部及胸廓，心臟采血約10 mL，分別注入血清管、肝素抗凝管及EDTA血常規(guī)管。肝素抗凝管2 000 r/min離心15 min、血清管5 000 r/min離心10 min，分別收集血清及血漿，400 μL/管分裝后-80℃冰箱保存，待測SCr、BUN、TG、CRP、TNF-α、TLR4等指標。提取各組腎臟和小腸的標本，經過10%福爾馬林溶液固定后，石蠟包埋，做HE染色，光鏡觀察。

2.4.2 檢測方法 采用Elisa法檢測CRP、TNF-α、 TLR4的濃度變化，嚴格按照試劑盒的說明，SCr、BUN、TG檢查應用日立公司70209全自動生化分析儀測定。

2.4.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19．0統(tǒng)計分析軟件對結果進行處理。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，若方差齊則采用LSD法，若方差不齊則采用Dunnett’T3法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 治療6周后各組血肌酐、尿素氮、甘油三酯的變化 見表1。

表1 治療后大鼠血SCr、BUN、TG情況比較（±s）Tab.1 Comparison of blood serum SCr,BUN and TG in rats after treatment（±s）

表1 治療后大鼠血SCr、BUN、TG情況比較（±s）Tab.1 Comparison of blood serum SCr,BUN and TG in rats after treatment（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；灌腸方組與辛伐他汀組比較，△P＜0.01。

組別 n SCr（μmol/L） BUN（mmol/L） TG（mmol/L）模型組 12 68．74±4．66 8．84±1．57 0．99±0．45灌腸方組 12 52．42±2．36*△8．76±1．35 0．65±0．20**辛伐他汀組 12 77．10±7．26 8．81±1．20 0．32±0．09*△

3.2 治療6周后各組CRP、TNF-α、TLR4的濃度變化 見表2。

表2 治療后大鼠血清CRP、TNF-α、TLR4的濃度比較（±s）Tab.2 Comparison of the concentration of blood serum CRP, TNF-α,and TLR4 in rats after treatment（±s）

表2 治療后大鼠血清CRP、TNF-α、TLR4的濃度比較（±s）Tab.2 Comparison of the concentration of blood serum CRP, TNF-α,and TLR4 in rats after treatment（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01，灌腸方組與辛伐他汀組比較，△△P＜0.05。

組別 n CRP（ng/mL） TNF-α（pg/mL） TLR4（ng/mL）模型組 12 12．19±1．97 30．15±0．75 12．93±1．53灌腸方組 12 08．03±0．86* 30．52±0．86 06．31±0．90*辛伐他汀組 12 07．16±1．19* 29．86±0．80 04．13±1．01*△△

3.3 各組大鼠腎臟及小腸的光鏡下病理情況比較腎臟的病理結果顯示模型組與辛伐他汀組普遍存在腎間質纖維化，局部小片狀彌漫性炎癥，并有曲管變性或腎小球變性萎縮、蛋白管型，這可能與手術切除腎組織造成的損傷及炎癥反應有關。灌腸方組切片的表現(xiàn)輕于其他兩組。其可能的機制是灌腸方打破了上述的循環(huán)，間接地減輕了腎小球內的壓力，解除了引起腎小球肥大的部分因素，從而減輕了5/6腎切除大鼠的腎臟病理改變。小腸的病理切片顯示絨毛水腫，固有膜炎細胞增多，模型組、中藥組、西藥組間沒有明顯的差異改變，也提示中藥灌腸對腸黏膜沒有損傷。

4 討論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學對于腎衰病的辨證論治中，“下法”是一類重要的治療大法。根據(jù)腎衰病本虛標實，濁毒內蘊的病理性質，針對其邪實正虛的病機，瀉邪法的運用必不可少，臨床運用多以通腑泄?jié)?、清熱利濕為主要的具體治法，其機理就是為了加強腸腑傳化功能來祛除體內濁毒之邪。高位灌腸是治療腎衰病的外治法之一，其通過腸道的交換使?jié)岫局翱焖儆行У呐懦鲶w外，在臨床上應用廣泛。在針對微炎癥狀態(tài)的中醫(yī)治療中，灌腸療法及中藥湯劑的運用發(fā)揮了多靶點治療的突出作用，已有研究證明[3]中藥能改善CKD炎癥反應，其機制可能與調節(jié)脂質代謝和改善細胞免疫功能有關。我院開展結腸透析中運用灌腸方高位保留灌腸，臨床驗證能有效的改善尿毒癥患者的臨床癥狀，降低血肌酐、尿毒氮的水平，延緩腎功能損害的進程。既往的藥理研究[6]已發(fā)現(xiàn)大黃的抑菌作用尤為突出，對繼發(fā)于細菌性腹膜炎的麻痹性腸梗阻有治療作用，蒲公英、牡蠣提取液也有一定的抑菌作用，且針對金黃色葡萄球菌大黃酸聯(lián)合抗生素有協(xié)同作用，故針對CRF存在的微炎癥狀態(tài)可通過中藥灌腸降低炎癥因子的表達，從而緩解患者的微炎癥狀態(tài)。他汀類藥物在慢性腎臟病中的運用已成為近幾年的研究熱點，在改善微炎癥和心血管事件中都存在一定的作用，能早期有效抑制炎癥反應、降低炎癥前因子和C-反應蛋白[7-9]，尤其是針對尿毒癥透析患者中長期存在的微炎癥狀態(tài)，早期運用在治療中能起到一定的協(xié)同作用[10-11]；這種抑制作用可通過下調Toll樣受體4（TLR4）和核轉錄因子-κB（NF-κB）的表達，抑制炎癥反應而實現(xiàn)[12-13]。

本研究觀察了5/6 CRF的模型的微炎癥狀態(tài)情況，驗證了CRF模型中微炎癥指標的升高，且持續(xù)數(shù)周，能初步斷定慢腎衰的一種持續(xù)的微炎癥狀態(tài)的存在性，這與近期的一些實驗研究結果相符[1,3,14]。微炎癥狀態(tài)是一種僅表現(xiàn)為實驗室指標異常而沒有明顯的臨床癥狀的狀態(tài)，臨床中通過主要檢測血清超敏CRP和ALB來判斷。本實驗中通過對CRP和TNF-α濃度的檢測來觀察微炎癥的情況，血清TNF-α的濃度均較高，提示其在腎衰中高表達誘導了持續(xù)的微炎癥狀態(tài)，而本實驗的兩種藥物干預未能有效的降低TNF-α的濃度值?？紤]可能與藥物的作用位點和靶點不同有關，可通過在基因水平上研究阻斷TNF-α高濃度的因子來開展更深入的研究。TLR4在腎臟中的意義是近年來研究的一個熱點問題，主要是因為它與NF-κB的表達關系密切，NF-κB是多系統(tǒng)疾病如心臟病、糖尿病、慢性腎臟病等的一個關鍵的表達因子，所以近年來成為多學科、跨領域臨床與實驗研究的焦點。本實驗中通過Elisa方法檢測了血清中TLR4的濃度水平，發(fā)現(xiàn)慢腎衰大鼠血清中的TLR4的濃度明顯高于正常組，其可能的機制與腎衰本身有關，辛伐他汀組的TLR4濃度明顯低于模型組和灌腸方組，且隨著用藥周期的延長能保持一個下降的趨勢。灌腸方組TLR4的濃度低于模型組但高于辛伐他汀組，且至6周也有一個下降的趨勢?？紤]可能與辛伐他汀阻斷了NF-κB的表達，進而抑制了TLR4的分泌有關。同時，病理結果也提示中藥灌腸對腎間質纖維化有一定改善。

本實驗結果表明中藥灌腸治療對尿毒癥微炎癥狀態(tài)有確切干預作用，表現(xiàn)為抑制CRP與TLR4分泌，其作用機制可能與辛伐他汀類似，即阻斷NF-κB的表達，進而抑制了TLR4的分泌。

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Effect on 5/6 nephrectomy rats with micro-inflammation state treated with TCM enema

JIANG Chen1,WANG Jia-li2,GONG Xin-ru1,ZHANG Lin1,ZHAI Jianxin1,YANG Hong-tao1
（1.Department of Nephropathy,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China;2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe effect to micro-inflammation state in experimental chronic renal failure(CRF)rats treated with TCM enema and explore it’s mechanism.[Methods]The 44 SD male rats were randomly divided into normal control group,model control group,enema group and simvastatin group.All rats were 5/6 nephrectomy surgery to become CRF animal models except normal control group.After model establishment,each group began to fill the stomach or enema for 6 weeks.The blood serum creatinine(SCr),blood urea nitrogen(BUN),triglyceride(TG),C reactive protein(CRP),transforming growth factor alpha(TNF-α),and toll like receptor 4(TLR4) were detected respectively at 1,3,6 weeks in each group,Animals were sacrificed at the end of the experiment to observe the morphological change of kidney and small intestine.[Results]The concentration of CRP and TNF-α were no statistical difference between enema group and simvastatin group.It suggested that the function of TCM enema was also similar to the role of statins in improving the micro-inflammatory state,and its mechanism may be related to blocking the expression of TLR4.Pathological results showed that enema group has a certain improving effect on renal interstitial fibrosis.[Conclusion]TCM enema can improve the CRF rat survival state,delay the progress of the disease,and have certain positive effect on renal interstitial fibrosis.The mechanism of action of TCM enema may relate to reducing inflammation factor expression,improve micro-inflammation state function.The function of TCM enema is similar to simvastatin.

5/6 nephrectomy;chronic renal failure;micro-inflammatory state;enema;simvastatin

R285.5

A

1672-1519（2014）09-0556-04

2014-03-09）

（本文編輯：馬 英，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.09.14

國家自然科學基金青年科學基金項目（No. 81302920）。

姜 晨（1982-），女，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，長期從事中西醫(yī)結合腎臟病工作。

楊洪濤，E-mail：tjtcmht@126.com。