HPLC法測定金黃膏中小檗堿和巴馬丁的含量*

劉俊紅，王 紅，李棣華，曲鵬飛，呂沅姍

（1．天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100；2．天津市中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

HPLC法測定金黃膏中小檗堿和巴馬丁的含量*

劉俊紅1，王 紅2，李棣華1，曲鵬飛2，呂沅姍1

（1．天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100；2．天津市中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

摘要：[目的]建立同時測定金黃膏中鹽酸小檗堿、巴馬丁含量的方法。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸（二元梯度洗脫），檢測波長為346 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。[結(jié)果]鹽酸小檗堿和巴馬丁的進樣量分別在0.007 25～0.145 μg，0.005 5～0.110 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為98.8%和100.9%。[結(jié)論]該方法操作簡便、重現(xiàn)性好，適用于金黃膏中巴馬丁和鹽酸小檗堿的含量測定。

關鍵詞：金黃膏；鹽酸小檗堿；巴馬丁；高效液相色譜法

如意金黃散出自明代陳實功編著的《外科正宗》[1]，由大黃、黃柏、姜黃、白芷、天花粉、天南星等組成，為2010年版《中國藥典》（一部）收錄的品種，臨床用于治療瘡瘍腫痛、丹毒流注、跌打損傷等證[2]?；谂R床適用癥的需要，已有多種其外用劑型如巴布劑[3]、乳膏劑[4]、貼劑[5]見于文獻報道。金黃膏作為本院制劑已使用多年，臨床療效確切?！吨袊幍洹飞弦?guī)定了如意金黃散中姜黃素的含量測定，也有用高效液相色譜（HPLC）測定散劑或貼膏劑中大黃5種成分、小檗堿或姜黃素的含量[6-8]。因為黃柏為君藥之一，本研究制定了金黃膏中黃柏有效成分小檗堿和巴馬丁的含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實驗材料

儀器：SSI PC2000型高效液相色譜儀(美國科學系統(tǒng)公司)，EZChrom Elite Client/Server色譜工作站，AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

藥品與試劑：如意金黃膏（天津市中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室提供），鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200911)，巴馬丁對照品（含量≥98%，天津科曼斯特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司），磷酸為分析純。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ApolloC18（4.6mm×250mm，5 μm），流動相：A相為乙腈，B相為0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫程序，見表1，流速1.0 mL/min，檢測波長346 nm，柱溫：30℃，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算不低于20 000。

表1 梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution table

2.2 方法學考察

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿和巴馬丁對照品，分別用乙腈配制成濃度為0.290 mg/min和0.221 mg/min的溶液，作為儲備液。再分別吸取儲備液50、100、250、500、800、1 000 μL，加入10 mL容量瓶，加乙腈稀釋定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 線性關系實驗 分別取上述對照品溶液各5μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定峰面積。色譜圖見圖1（B）。以各對照品進樣量（X，μg）對峰面積（Y^，mAu）進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab.2 Regression equation and linear range

2.2.3 供試液的制備 取藥膏1.5g，精密稱質(zhì)量，加入三角瓶中，加石油醚（60~90℃）30mL超聲處理5min，取出，靜置，小心吸取上層溶液，再加入石油醚20mL，充分振搖洗滌，靜置，再小心吸取上層溶液，殘渣揮干溶劑。用25 mL的甲醇-0.1%磷酸水（1∶1）溶液分次轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，超聲處理30 min，取出，放冷，加入提取溶劑至刻度，過膜，即得。

2.2.4 精密度實驗 取供試品溶液，連續(xù)進樣5次，分別得出巴馬丁和鹽酸小檗堿的峰面積，計算相對標準偏差（RSD），鹽酸小檗堿為2.04%，巴馬丁為1.95%。表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，于不同時間間隔進樣測定，得到峰面積進行統(tǒng)計，鹽酸小檗堿RSD 1.51%，巴馬丁RSD 2.03%。表明兩種成分在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.6 重現(xiàn)性實驗 按2.2.3項下制備供試品溶液的方法制備樣品5份，分別測定并計算含量。結(jié)果巴馬丁RSD 3.87%，鹽酸小檗堿RSD 1.17%。表明兩種成分含量測定方法的重現(xiàn)性較好。樣品色譜圖見圖1（A）。

圖1 HPLC-UV色譜圖Fig．1 HPLC-UV chromatogram

2.2.7 專屬性實驗 除去黃柏，按處方比例稱取金黃膏其余藥味組成，制備金黃膏。參照2.2.3項下制備陰性供試液，同樣品方法測定，色譜圖見圖1（C）。結(jié)果基本沒有干擾。

2.2.8 加樣回收率實驗 精密稱取1.5 g藥膏6份，分別加入標準品巴馬丁和小檗堿儲備液各一定量，同上脫脂方法操作，然后用50 mL的甲醇-0.1%磷酸水（1∶1）溶液分次轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超聲處理30 min，取出，放冷，加入提取溶劑至刻度，過膜，即得。進樣20 μL。平均回收率巴馬丁為98.8%，RSD 1.85%，鹽酸小檗堿為100.9%，RSD 2.5%。

3 討論

3.1 金黃膏基質(zhì)為脂溶性，而且用量大 對提取溶劑進行篩選時，發(fā)現(xiàn)即使高濃度的乙醇或甲醇均不能將藥膏打散使其均勻分散，因此先用乙醚或石油醚脫脂，不僅可以去除基質(zhì)，同時還可以去除其他脂溶性成分。篩選石油醚用量時，分別用（30，30mL）、（30，20mL）和30mL超聲處理，通過色譜分析，30mL脫脂的樣品中指標峰不能達到基線，另兩種方法對指標峰及其他峰的影響差異不大，因此選用30 mL脫脂，20 mL洗滌。

3.2 提取溶劑的篩選 據(jù)報道甲醇對小檗堿的溶解度優(yōu)于乙醇[9]，分別篩選了甲醇或乙腈與0.1%磷酸水溶液的混合溶劑，以巴馬丁和小檗堿的含量之和為標準，結(jié)果甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）≈乙腈-0.1%磷酸水溶液（1∶1）＞乙腈-0.1%磷酸水溶液（3∶1）＞乙腈-0.1%磷酸水（1∶3）溶液＞0.1%磷酸水溶液，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）。

3.3 超聲時間和溶劑用量的篩選 分別考察提取時間為30、40、50 min，溶劑體積為25 mL和50 mL。結(jié)果提取的巴馬丁和小檗堿含量差異不明顯，選擇超聲處理30 min，提取溶劑用量為25 mL即可。

3.4 檢測波長的選擇 鹽酸小檗堿在波長346 nm與265 nm處有最大吸收，巴馬丁也吸收較強，吸收程度差別不大。相對來說，波長346 nm處基線較直，其他峰對鹽酸小檗堿和巴馬丁的干擾小，比較穩(wěn)定，因此選擇346 nm。

3.5 流動相的選擇 考察了幾種流動相，如乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀（5%磷酸調(diào)pH 3）[10]、乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液[11]、乙腈-0.1%磷酸水溶液中加入十二烷基磺酸鈉，還有乙睛-0.1%磷酸水溶液[12]等度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾種流動相對小檗堿的影響不大，峰形較好，但其前面的巴馬丁和其他的峰形和分離度較差，而且十二烷基磺酸鈉黏性較大，泡沫性強。最后考慮使用梯度洗脫，結(jié)果較滿意。

本實驗考察了黃柏中其他生物堿，其中保留時間（Rt）為5.0 min的是鹽酸黃柏堿，Rt為8.6 min的是藥根堿，由于含量更低，或有干擾，誤差大，沒有計算在內(nèi)。

參考文獻：

[1]陳實功.外科正宗[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1964.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：720．

[3]陳永財，邵炳忠.如意金黃散巴布劑制備工藝研究[J]．中國藥師，2008，11（12）：1434-1436.

[4]朱倩云，李筱青，李成網(wǎng).氮酮對如意金黃乳膏體外透皮吸收的影響[J]．中國實驗方劑學雜志,2011,17(20):24-26.

[5]毛 平，夏卉莉.如意金黃貼膏與如意金黃散消腫止痛功效的比較研究[J]．中國實驗方劑學雜志，2004，10（5）：46.

[6]楊以平，張師愚．HPLC法同時測定如意金黃散中大黃素、姜黃素、小檗堿的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012，14（9）：213-214．

[7]韓 剛，張衛(wèi)國，王 超，等．高效液相色譜法測定如意金黃散5種成分的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2007，27(1)：124-125．

[8]毛泉明，毛 平，葉福媛，等．反相高效液相色譜法測定如意金黃貼膏中小檗堿的含量[J]．中國醫(yī)院藥學雜志，2002，22（8）：477-478．

[9]秦紅霖，高 月，劉麗麗．高效液相色譜法測定燒傷Ⅱ號中鹽酸小檗堿的含量[J]．天津中醫(yī)藥，2005，22（3）：246-247.

[10] 崔向微，張貴君，李 慧．葛根芩連湯中7種藥效組分分析[J]．天津中醫(yī)藥，2008，25（5）：417-418．

[11]蔡清宇，張 沂，郝 特，等．HPLC法測定舒利通顆粒中巴馬丁和小檗堿的含量[J]．中國實驗方劑學雜志，2010，16（2）：40-42．

[12]唐洪梅，廖小紅，何嘉侖，等．HPLC法測定腸激安制劑中芍藥苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿[J]．中成藥，2012，34（5）：853-857．

（本文編輯：高 杉，于春泉）

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1672-1519（2014）02-0110-03

收稿日期：（2013-09-20）

*基金項目：國家自然科學基金面上項目（81072818）。

作者簡介：劉俊紅（1968－），女，副研究員，研究方向為中藥制劑工藝及質(zhì)量標準研究。

通訊作者：王 紅，E-mail:ctwanghong@sina.com。

Determination of berberine and palmatine in Jinhuang cream by HPLC

LIU Jun-hong1,WANG Hong2,LI Di-hua1,QU Peng-fei2,LV Yuan-shan1
（1.Tianjin Institute of Acute Abdomen by Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin 300100，China;2.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300150，China）

Abstract:[Objective]To establish a method for simultaneous determination of berberine and palmatine in Jinhuang cream.[Methods] A HPLC method was performed on Apollo C18(250 mm×4.6 mm,5 μ)column.The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）with the detection wavelengh at 346 nm.The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was at 30℃.

[Results]The content of berberine hydrochloride in the range of 0.007 25~0.145 μg and the content of palmatine in the range of 0.005 5~ 0.110 μg had good linear relationships with the area of eluted peak，and the recovery rate（the average recoveries）was 98.8%and 100.9% respectively.[Conclusion]This method is simple and repeatable,and is suitable for the content determination of berberine and palmatine in Jinhuang cream.

Key words：Jinhuang cream;berberine hydrochloride;palmatine;HPLC