大孔吸附樹脂純化豆腐柴多糖工藝研究

陶阿麗，蘇 誠，劉亞賽，余大群

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

大孔吸附樹脂純化豆腐柴多糖工藝研究

陶阿麗，蘇 誠，劉亞賽，余大群

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

通過研究D-101、AB-8、NK-9等五種不同型號大孔樹脂的吸附率及解吸率，確定分離純化豆腐柴多糖的樹脂類型.以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外可見分光光度法，測定各種樹脂吸附與解吸附前后的吸光度，以豆腐柴多糖的吸附量和解吸量為指標(biāo)，進(jìn)行樹脂的篩選.在五種不同型號的大孔吸附樹脂中，D-101型大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸能力較好，對豆腐柴多糖的動態(tài)吸附率約為21.5%，動態(tài)解吸附率為34.4%.在本實驗條件下，D-101型大孔吸附樹脂是分離純化豆腐柴多糖較好的材料.

豆腐柴；大孔樹脂；吸附；解吸

豆腐柴（PremnamicrophyllaTurcz.）又名臭黃荊、豆腐木、腐婢，為馬鞭草科豆腐柴屬多年生落葉灌木，是一種藥食兼用的植物.豆腐柴的根、葉、莖均可入藥，具消腫止血、清熱解毒等功效[1].豆腐柴葉營養(yǎng)豐富，富含果膠，可用于果膠提取，也可作為綠色食品的原料.我國豆腐柴野生資源豐富，大多野生于山坡、林下、林緣或荒山中，對土質(zhì)要求不嚴(yán)，在貧瘠的土地上也能根深葉茂，長期以來處于自然生長狀態(tài).由于豆腐柴具有較高藥用和食用價值，近年來對其開發(fā)利用逐漸受到重視，這也將為豆腐柴大面積種植、綠化荒山、促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展起到積極的推進(jìn)作用.本文主要針對近幾年豆腐柴的開發(fā)利用進(jìn)行綜述.

大量實驗研究說明，植物多糖具有增強機體的免疫功能、降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老等多種生物學(xué)功能，植物多糖的生物學(xué)功效研究已經(jīng)成為現(xiàn)在生物學(xué)熱門領(lǐng)域之一.目前，對豆腐柴果膠的研究報道較多，卻鮮有豆腐柴多糖含量測定和分離純化的報道.我們采用咔唑-硫酸法，建立了豆腐柴多糖分離純化的研究方法.近年來，人們圍繞著豆腐柴多糖的提取分離結(jié)構(gòu)鑒定藥理等方面展開了深入細(xì)致的研究.而豆腐柴多糖的分離純化是主要問題，是一種快速簡便安全成本低純度高而又不破壞成分的提取純化方法.對豆腐柴多糖分離純化研究的進(jìn)一步探索，為今后豆腐柴的綜合利用和其他相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了新的思路，并為豆腐柴進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ).研究表明，大孔樹脂對多糖的純化效果較好[2]，而且現(xiàn)在已經(jīng)有很多藥廠應(yīng)用了能量產(chǎn)的大孔樹脂純化生產(chǎn)設(shè)備.本文是針對大孔樹脂對豆腐柴中多糖的分離純化進(jìn)行研究，優(yōu)化多糖的純化工藝，以期對工業(yè)化生產(chǎn)帶來幫助和意義.

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 試劑

濃硫酸（AR）、蒸餾水、95%乙醇（AR）、三氯甲烷（AR）、無水乙醇（AR）、正丁醇（AR）等；皖南豆腐柴，D-101型、NK-9型、AB-8型、X-5型、D-3520型：均購自蚌埠遼源有限公司.

1.1.2 儀器

DHG-9101-3SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；722型可見分光光度計：上海成光儀器有限公司；FA2004型電子天平：上海良平儀器有限公司；FY130中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；LD5-10低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；HH-S2恒溫水浴鍋：上海普渡生化科技有限公司；層析柱（30cm×2.5cm）：江蘇省高郵市亞泰科教儀器廠；RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠等.

1.2 方法

1.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

在95%乙醇浸泡24h，濕法裝柱，用95%乙醇溶液以2BV/h(BV指樹脂的柱體積，單位為mL)的流速通過樹脂柱，水洗至中性，流出液加2倍蒸餾水至沒有渾濁產(chǎn)生為止；再用蒸餾水洗至流出液澄清，然后用2BV的5%的HCl溶液洗層析柱，浸泡3h，再用水洗至中性，用2%的氫氧化鈉進(jìn)行同樣的處理.最后在60度恒溫干燥箱干燥，備用；即處理完畢[3-4].

1.2.2 粗多糖的制備

稱取干燥粉碎的豆腐柴50g加2倍體積的無水乙醇進(jìn)行回流2次，每次2h，過濾.用水提醇沉法提?。簽V渣晾干后加蒸餾水在恒溫水浴鍋攪拌提取，溫度控制在95℃左右，反復(fù)提取2-3次，每次4-6小時.得到多糖的提取液，用離心法除去不溶性雜質(zhì)，進(jìn)行濃縮.濃縮液用Sevage法去除蛋白質(zhì)[5]，將多糖水溶液、氯仿、正丁醇按25：5：1的比例混合，劇烈震蕩20min；離心，分去水層與溶液層交界處的變性蛋白，一般重復(fù)5次，然后加入2倍量的95%乙醇，室溫靜置5h，濾取沉淀物，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚，多次洗滌，放入恒溫干燥箱中50℃干燥，即得粗多糖[6].取粗多糖配成一定濃度的溶液，采用硫酸-咔唑法測定多糖含量.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.0250g半乳糖醛酸于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用水稀釋并定容.用移液管精密移取上述稀釋液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于6個100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得到濃度分別為10、20、30、40、50、60μg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用.

0.15 %咔唑無水乙醇溶液：稱取0.1500g的咔唑置燒杯中，加入無水乙醇溶解后定容于100mL容量瓶中備用.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL于6個試管中，加入0.5mL0.15%咔唑無水乙醇溶液，并產(chǎn)生白色絮狀沉淀，不斷搖動試管，再加入6mL濃硫酸.立刻將試管放入85℃水浴里5min，再使之冷卻15min.然后立刻用722型可見分光光度計在530nm波長處，用1cm比色皿測量吸光值，空白試劑為參比.以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7].得曲線方程為A=0. 0049C+0.1125，r=0.9994，曲線見圖1.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 靜態(tài)吸附及解吸附實驗

選擇D-101型、NK-9型、X-5型、D-3520型、AB-8型5種不同的大孔吸附樹脂，先考察它們的靜態(tài)吸附和解吸附實驗的吸附及解吸附能力.

分別稱取5種預(yù)處理后的大孔樹脂2g，置于100mL的錐形瓶中，精密加入30ml多糖溶液，在恒溫震蕩器中震搖（100r/min,溫度為30℃）24h后，測定殘液中豆腐柴多糖的吸光度，計算吸附量[8].

分別取做靜態(tài)吸附的實驗完畢的樹脂，抽慮至干燥，置于100mL的錐形瓶中，加入50%乙醇溶液30mL，在同樣條件下，測定解吸液中豆腐柴多糖溶液的吸光度.計算解吸量.計算公式如下：

式中，C0-吸附前樣品的起始濃度，C1-吸附后樣品液的殘余濃度，V1-加入多糖液的體積（mL）, V2-解吸液體積（mL），W-樹脂的重量（g），C-解吸液濃度（mL）.

1.2.5 動態(tài)吸附及解吸實驗

1.2.5.1 裝柱

選取靜態(tài)吸附效果較好的3種樹脂，用電子天平精密稱取15g，濕法裝柱.

1.2.5.2 配制上樣液

提取豆腐柴的粗多糖加蒸餾水溶解，稀釋成一定濃度，并測定其濃度，充分搖勻后上樣.

1.2.5.3 上樣

用玻璃棒沿層析柱管壁緩慢加入上樣液，控制流出液的流速恒為1.5BV/h，每10min接一次流出液.上樣完全后，用蒸餾水洗柱，直到流出液與95%乙醇混合不產(chǎn)生渾濁為止[9].

1.2.5.4 洗脫

水洗完畢后，量取2BV的50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為2BV/h，每10min接一次.

1.2.5.5 豆腐柴多糖的吸光度測定

分別測定不同時間段接取的吸附后殘液和洗脫液的吸光度，公式如下：

其中，C0-吸附前樣品的起始濃度（mg/mL），C1-吸附后樣品液的濃度（mg/mL），C2-解吸液多糖的濃度（mg/mL），V-上樣液的體積（mL）,V1-解吸液體積（mL）[10].

2 討論

2.1 靜態(tài)吸附及解解吸附實驗結(jié)果

精密稱取預(yù)處理后的大孔樹脂2g，進(jìn)行靜態(tài)吸附及解吸附實驗，并測定吸附殘液及解吸液中豆腐柴多糖的吸光度，計算得不同型號的大孔吸附率及解吸率.結(jié)果見表1、圖2.

表1 5種樹脂的靜態(tài)吸附解吸實驗結(jié)果

圖2 5種樹脂的靜態(tài)吸附解吸實驗效果

由表1、圖2可以看出5種不同型號的大孔吸附樹脂對豆腐柴多糖的靜態(tài)吸附及解吸附實驗中，D-101、D-3520、NK-9型大孔吸附樹脂對豆腐柴多糖都有較好的吸附及解吸性能.

2.2 動態(tài)吸附及解吸性能的篩選

準(zhǔn)確稱取靜態(tài)吸附效果較好的不同型號大孔樹脂各15mg(抽濾干燥)，用蒸餾水濕法裝柱，進(jìn)行動態(tài)吸附及解吸實驗，測吸附殘液和洗脫液中豆腐柴多糖的吸光度，計算不同時間接收液中豆腐柴多糖的濃度.結(jié)果見表2、圖3.

表2 3種樹脂的動態(tài)吸附及解吸附實驗結(jié)果

圖3 5種樹脂的動態(tài)吸附及解吸附實驗結(jié)果

從表2、圖3可看出來：在以上三種大孔吸附樹脂中，D-101型大孔樹脂對豆腐柴多糖的動態(tài)吸附率和解吸率均較好，動態(tài)吸附率21.5%，動態(tài)解吸率34.4%，因此，在本實驗條件下，D-101型大孔樹脂為豆腐柴多糖分離純化的較好樹脂.

3 結(jié)論

本實驗以D-101，AB-8，HPD-400等5種不同型號的大孔吸附樹脂，對水煮醇沉法提取的豆腐柴多糖進(jìn)行吸附和解吸性能的考察，通過靜態(tài)吸附解吸實驗和動態(tài)吸附解吸實驗，考察了不同型號的樹脂對豆腐柴多糖的吸附及解吸能力.

實驗結(jié)果表明：在五種不同型號的大孔吸附樹脂中，D-101型大孔樹脂對豆腐柴多糖的靜態(tài)吸附及解吸能力和動態(tài)吸附及解吸附能力的效果較好，對豆腐柴多糖的動態(tài)吸附率約為21.5%，動態(tài)解吸附率為34.4%.結(jié)論：在本實驗條件下，D-101型大孔吸附樹脂是分離純化豆腐柴多糖較好的材料.

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R284.2

A

1673-260X（2014）02-0036-03

2012年度國家級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201212216021）