CA-074Me對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究

龔曉燕張智博

（1 湖南旺旺醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410016；2 長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙410005）

CA-074Me對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究

龔曉燕1張智博2

（1 湖南旺旺醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410016；2 長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙410005）

【摘要】目的探討CA-074Me對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用。方法 將90只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=10），腦缺血再灌注模型組（n=40），CA-074Me治療組（n=40）。線栓法制備大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）模型，TTC染色檢測(cè)腦梗死體積，TUNEL法原位檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果模型組大鼠腦缺血再灌注后1 h后TTC染色即可顯示梗死灶，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)明顯增多（P＜0.05），CA-074Me治療可明顯減少大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積（P＜0.05），及其神經(jīng)細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)（P＜0.05）。結(jié)論CA-074Me 治療能減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

【關(guān)鍵詞】腦缺血再灌注；TTC；凋亡；CA-074Me

CA-074Me是一種甲基化環(huán)氧氯琥珀酰膽堿，Cathepsin B的抑制劑，對(duì)腫瘤、病毒性心肌炎等顯示出良好的效果[1-4]，但未見(jiàn)在腦缺血再灌注中的作用的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備

選取體質(zhì)量在（250±20）g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只，大鼠周齡在10～12周左右，均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部門(mén)提供。將90只健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、CA-074Me腹腔注射治療干預(yù)組3組，假手術(shù)組有10例，模型組與干預(yù)組每組均為40例。模型組與干預(yù)組兩組根據(jù)再灌注時(shí)間的不同分為4個(gè)亞組，具體指標(biāo)如下：按灌注時(shí)間的不同，1、6、24、48 h各分成4個(gè)不同的亞組，每組為10只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，其中5只用來(lái)做TTC染色，另5只做原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)。參考Longa[4]的線栓法，制作模型，模型為局灶性右側(cè)大腦動(dòng)脈梗死，在健康雄性Sprague-Dawley大鼠缺血2 h后拔出線栓，采用再灌注。假手術(shù)組健康雄性Sprague-Dawley大鼠插入線栓，保證插入線栓的深度為8～10 mm范圍內(nèi)。對(duì)干預(yù)組大鼠進(jìn)行再灌注操作之后，使用腹腔注射方式注入CA-074Me 0.4 mg/kg。假手術(shù)組與模型組在同一時(shí)間，將等量相同濃度的氯化鈉注射液注射至大鼠腹腔內(nèi)部。

1.2 腦梗死體積測(cè)定（TTC染色）

在進(jìn)行大鼠腦梗死體積測(cè)定之前，需要將大鼠進(jìn)行深度麻醉處理，接著迅速切斷大鼠頭部，取出大鼠大腦，并將其放置于-80 ℃冰箱速凍10 min。接著提取大鼠的前腦，切成五層厚度為2 mm的冠狀腦片，切片區(qū)段為額極到枕極，并迅速將五層冠狀腦片置于避光2%濃度的TTC溶液中，然后恒溫孵育30 min，采用4%濃度多聚甲醛進(jìn)行固定2 h。經(jīng)過(guò)上述處理之后，被染成鮮紅色部分則為正常腦部組織，呈蒼白色為腦部梗死區(qū)域。然后根據(jù)計(jì)算公式（A1+A2+A3+……+An）t-（A1+An）t/2=V算出大鼠前腦的體積與梗死區(qū)域的體積。

1.3 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）

在大鼠達(dá)到缺血再灌注的最佳時(shí)間時(shí)，將大鼠進(jìn)行開(kāi)胸處理，暴露出大鼠心臟，刺穿其左心室并對(duì)其主動(dòng)脈進(jìn)行快速灌注，灌注采用濃度為0.01 moL/L PBS藥液，接著采用250 mL 4%多聚甲醛緩沖液，對(duì)大鼠左心室由快到慢進(jìn)行灌注固定，固定時(shí)間維持在3～4 h，取出大鼠前腦，使用濃度為30%蔗糖液進(jìn)行灌注固定，固定時(shí)間在24 h左右，在缺血灶范圍做腦連續(xù)冠狀冰凍切片。大鼠凋亡細(xì)胞詳細(xì)觀察與計(jì)數(shù)方式：凋亡細(xì)胞核一般呈現(xiàn)為黑褐色，在光鏡下可以較為直觀的發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞會(huì)破裂成為較小的碎片狀物質(zhì)或者變成凋亡體，正常細(xì)胞核一般呈現(xiàn)為紅色，變紅的原因主要是由于核固紅復(fù)染導(dǎo)致。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（）表示，組間計(jì)量資料比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以雙尾P＜0.05差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 TTC染色結(jié)果

TTC染色示：假手術(shù)組大鼠沒(méi)有出現(xiàn)梗死灶，模型組大鼠在再灌注后1 h便出現(xiàn)呈蒼白色的缺血側(cè)梗死灶，隨著再灌注后時(shí)間的增長(zhǎng)，前腦梗死體積逐漸增大，于再灌注后48 h達(dá)最大（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（，n=5）

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（，n=5）

組別　　大鼠腦梗死體積與大鼠前腦總體積比(%)模型組24h　22.08±2.20干預(yù)組24h　18.26±0.78

2.2 腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的變化

將模型組試驗(yàn)結(jié)果同假手術(shù)組進(jìn)行對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)模型組再灌注6 h后，在大鼠缺血側(cè)壞死灶周?chē)蛲黾?xì)胞數(shù)量顯著增多并且隨著時(shí)間的推移逐漸上升，直至再灌注48 h左右達(dá)高峰。將干預(yù)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果同模型組進(jìn)行對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)CA-074Me腹腔注射治療后，大鼠腦缺血再灌注6 h后，在大鼠缺血側(cè)壞死灶周?chē)蛲黾?xì)胞數(shù)量明顯降低，再灌注完成后6 h直至再灌注完成后48 h之間大鼠缺血側(cè)壞死灶周?chē)蛲黾?xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05～0.001），見(jiàn)表2。

3 討 論

在正常狀態(tài)下，Cathepsin B一般以酶原形式儲(chǔ)存在溶酶體中，而在如炎性因子等致病情況的影響下，會(huì)降低生物體體內(nèi)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性逐漸增加，一旦細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低嚴(yán)重，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生破裂[5]。Seyfried D等發(fā)現(xiàn)在腦梗死時(shí)表達(dá)增高，參與神經(jīng)元凋亡，同時(shí)CA-074Me 治療能顯著減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

表2 缺血側(cè)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的動(dòng)態(tài)變化（個(gè)，n=5）

表2 缺血側(cè)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的動(dòng)態(tài)變化（個(gè)，n=5）

注：與假手術(shù)組比較○P＜0.05；與模型組比較△P＜0.05

組別　1 h　6 h　24 h　48 h假手術(shù)組　 5.38±1.21　-　-　-模型組 　19.40±3.15○　25.30±3.19○　43.47±3.28○　50.08±2.19○干預(yù)組　13.80±3.01○△　16.40±1.67○△　33.68±2.76○△　38.40±2.36○△

參考文獻(xiàn)

[1] 李琳,張志強(qiáng).腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].中華物理學(xué)與康復(fù)雜志 2005,1(27): 60-62.

[2] Benchoua A,Braudeau J,Reis A, et al.Activation Of Proinflammatory Caspases by Cathepsin B in Focal Cerebral Ischemia[J]. Cerebral Blood Flow Metabolism,2004,24(11):1272-1279.

[3] Seyfried D,Han Y,Zheng Z,et al.Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat[J].Neurosurg,1997,87(5):716-723.

[4] 于小華,張新剛,王時(shí)俊,等.組織蛋白酶B抑制劑CA-074Me對(duì)小鼠病毒性心肌炎的干預(yù)作用[J].臨床兒科雜志,2005,23(1):52-54.

[5] Roeby S,Sloane BF,Bloin K.Pericellular cathepsin B and malignanta progression[J].Cancer Metastasis Rev,2003,22(3):271-286.

中圖分類(lèi)號(hào)：R965

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2014）15-0070-02