芳香烴受體（AhR）在乳腺癌中的表達(dá)及其與阿霉素化療耐藥的相關(guān)性

李正東楊新偉成小林莊志剛童曉文

(1同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院乳腺外科 上海 200040；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)外科 上海 200071；3同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海 200065)

芳香烴受體（AhR）在乳腺癌中的表達(dá)及其與阿霉素化療耐藥的相關(guān)性

李正東1楊新偉2成小林1莊志剛1童曉文3△

(1同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院乳腺外科 上海 200040；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)外科 上海 200071；3同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海 200065)

目的觀察芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)在乳腺癌組織中的表達(dá),并探討乳腺癌細(xì)胞AhR表達(dá)與阿霉素化療耐藥的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化染色法觀察AhR在50例乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá),其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌40例,正常乳腺組織10例。采用Ah R-siRNA表達(dá)載體和脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因沉默Ah R高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR；RT-PCR和Western bolt法檢測轉(zhuǎn)染后Ah R mRNA及蛋白的表達(dá)；MTT法檢測細(xì)胞增殖活性及轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞對阿霉素敏感性的變化。結(jié)果Ah R在乳腺癌組織表達(dá)率為82.0% (46/50)、在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)率為92.5%(37/40),而在正常乳腺組織中10%(1/10)有表達(dá)。乳腺癌及乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中AhR的表達(dá)均顯著高于正常乳腺組織(P＜0.05)?；虺聊珹hR高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR后24 h,PCR和免疫印跡結(jié)果均顯示乳腺癌細(xì)胞株Ah R基因及蛋白表達(dá)水平降低。MTT顯示AhR基因沉默對乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖活性有顯著的抑制作用,48 h細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)52%。Ah R沉默后乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的半數(shù)有效濃度(IC50)由(18.2±0.9)μmol/L降低至(8.4±1.1)μmol/L (P＜0.05)。結(jié)論siAhR能夠有效抑制AhR基因的表達(dá),降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。AhR對阿霉素耐藥過程發(fā)揮作用,沉默Ah R表達(dá)能一定程度上逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥現(xiàn)象。

乳腺癌； RNA干擾； 化療耐藥； 阿霉素

目前乳腺癌的主要治療方法是手術(shù)結(jié)合化療的綜合治療,而乳腺癌細(xì)胞在化療中產(chǎn)生的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一［1］。由于阿霉素類化療藥物在乳腺癌輔助化療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的解救治療中被廣泛應(yīng)用,因此研究阿霉素化療耐藥的逆轉(zhuǎn)具有重要意義。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)作為一種廣泛分布于人體多個(gè)器官的配體誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子,參與多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)且與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道Ah R在前列腺癌、肝癌、卵巢癌中均有高表達(dá)［2-4］。本研究觀察AhR在乳腺癌組織中的表達(dá)情況,并采用AhR高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA基因,探討Ah R表達(dá)與乳腺癌阿霉素化療耐藥的關(guān)系,為臨床阿霉素類化療耐藥個(gè)體提供治療依據(jù)。

資料和方法

材料和試劑50例乳腺癌石蠟標(biāo)本,其中非特殊性浸潤性導(dǎo)管癌46例,神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例,髓樣癌3例。乳腺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌40例,正常乳腺組織10例。組織芯片購自陜西超英生物公司(BR1008)；MCF-7/ADR細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究所提供,常規(guī)培養(yǎng)傳代；Ah R引物

序列由上海生工合成。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、阿霉素(美國Gibico公司),DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司),Ah R抗體(美國Invitrogen公司),脂質(zhì)體2000、Ah R-siRNA(美國Santa Cruz公司),MTT(美國Promege公司),RTPCR試劑盒(美國MBI公司),兔抗人Ah R單克隆抗體及SP試劑盒(美國Biomol公司)。

免疫組化染色切片常規(guī)HE染色,采用鏈霉素親和素一過氧化酶復(fù)合物法(SP法)行Ah R免疫組化染色,Ah R一抗按1∶500稀釋,實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按即用型Max VisionTM試劑盒說明書進(jìn)行。以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為Ah R陽性,在顯微鏡下采集5個(gè)不重疊的高倍視野(×400),用數(shù)字顯微攝影系統(tǒng)拍照,由2位病理科醫(yī)師分別評估。Ah R評估采用Remmele等提出的免疫反應(yīng)評分(immume response scores,IRS),依據(jù)免疫組化染色范圍記分為0～4(0～4個(gè)視野),染色深度記分為0～3(弱、中、強(qiáng)),因此染色總評分為0～12。

構(gòu)建載體及細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照siRNA設(shè)計(jì)原則,結(jié)合AhR基因序列特征,設(shè)計(jì)siAhR序列。引物1：3ˊ-ATCAAGCGCTCGGGGCACCATGAACA-5ˊ,引物2：3ˊ-CCCATGGCAGCTGACGCCGAGATCTGGA-5ˊ。Ah R-siRNA組：轉(zhuǎn)染si Ah R,特異性干擾目的基因AhR表達(dá)；空脂質(zhì)體對照組：轉(zhuǎn)染siNC,對AhR無沉默作用。將Ah R siRNA組和空脂質(zhì)體組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理。常規(guī)培養(yǎng)MCF-7/ADR細(xì)胞,使細(xì)胞密度達(dá)80%。用無血清雙抗培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體2000和siRNA至所需濃度,室溫靜置5 min,混勻,室溫靜置20 min,形成穩(wěn)定的siRNA-脂質(zhì)體混合物。將待轉(zhuǎn)細(xì)胞加入上述混合物,6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

RT-pCR檢測Ah R-siRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染后24 h收集兩組細(xì)胞,參照Trizol說明書,提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建立PCR反應(yīng)體系,以GAPDH為內(nèi)參,對RT-PCR目的基因Ah R進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物為368 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,觀察各條帶吸光度(D)值,用Ah R/GAPDH灰度值表示AhR mRNA相對含量。

Westernblot檢測AhR蛋白表達(dá)將細(xì)胞低密度鋪于6孔板,24 h后用快速制備法提取核蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后雜交,一抗為兔抗人Ah R單抗,二抗為鼠抗兔多抗,以NBT/BCIP顯色。采用圖像處理儀分析處理,測定D值并計(jì)算其與空白對照組的比值。

MTT法檢測細(xì)胞增殖按上述為法處理細(xì)胞,處理后24、48、72和96 h分別收集細(xì)胞,行MTT染色,酶標(biāo)儀下570 nm波長處測定D值,計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(%)=(空白組D值-處理組D值)/空白組D值×100%。

MTT法檢測耐藥逆轉(zhuǎn)效果轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞,細(xì)胞濃度整至1×105/m L,取單細(xì)胞懸液100 μL,加入終濃度為0.1、1、10、100μmol/L的阿霉素,常規(guī)MTT法檢測試驗(yàn)細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的生存率,每個(gè)濃度梯度均設(shè)對照組和空白調(diào)零孔。在酶標(biāo)儀上以570 nm和630 nm雙波長檢測D值。終D值=D570-D630,TCL=加藥組D值/對照組D值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍,取平均值,采用Graphpad Prism軟件計(jì)算IC50。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件,計(jì)量資料用x—±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

AhR在乳腺癌、乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及正常乳腺組織中的表達(dá)應(yīng)用免疫組化方法發(fā)現(xiàn),Ah R在82.0%的乳腺癌組織(46/50)、92.5%的乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(37/40)及10%的正常乳腺組織(1/10)中均有表達(dá)。免疫組化陽性染色主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì),乳腺癌組織中的表達(dá)陽性率及表達(dá)水平均高于癌旁正常乳腺組織。采用IRS評估Ah R免疫組化,乳腺癌組及乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組的評分均明顯高于乳腺癌勞正常組織(P＜0.05)。而乳腺癌組與乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組之間的評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05,圖1)。

siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的AhRmRNA表達(dá)空載體組和siRNA組細(xì)胞在452 bp處均擴(kuò)增出GAPDH條帶,掃描D值在24 h時(shí)基本相同。轉(zhuǎn)染24 h后siAhR組在368 bp處可見淺擴(kuò)增條帶,而對照組在相應(yīng)部位可見特異性條帶(圖2)。轉(zhuǎn)染24 h后,siAhR組的Ah R mRNA相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組,說明siRNA成功干擾目的基因AhR的mRNA表達(dá)。

AhR-siRNA表達(dá)質(zhì)粒對AhR蛋白表達(dá)的影響MCF-7/ADM乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siAh R后24 h,Ah R蛋白水平顯著低于對照組,表明轉(zhuǎn)染后MCF-7/ ADR的AhR基因表達(dá)受到抑制(圖3)。

轉(zhuǎn)染siAhR后對乳腺癌細(xì)胞增殖活性的影響由細(xì)胞生長曲線可見,si Ah R轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR后細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制(P＜0.05),48 h抑制率可達(dá)52%(圖4)。

轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞對阿霉素敏感性的變化siAhR組、空脂質(zhì)體對照組阿霉素IC50值分別為(8.4±1.1)和(18.2±0.9)μmol/L。siAh R組明顯低于對照組(P＜0.01),結(jié)果提示AhR表達(dá)水平下調(diào)后,乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR部分恢復(fù)了對阿霉素的敏感性,阿霉素耐藥性得到逆轉(zhuǎn)(圖5)。

討 論

化療藥物的原發(fā)或繼發(fā)耐藥是導(dǎo)致乳腺癌患者臨床化療失敗的主要原因之一。阿霉素類藥物是目前臨床上治療乳腺癌最常用的藥物,其在乳腺癌術(shù)后輔助化療、新輔助化療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的解救化療中均發(fā)揮著重要作用［5］,因此研究乳腺癌的阿霉素類藥物耐藥具有明確的臨床意義［6］。阿霉素耐藥機(jī)制多樣,目前仍不能確定?，F(xiàn)認(rèn)為腫瘤最常見的耐藥機(jī)制是多藥耐藥糖蛋白介導(dǎo)的MDR［7］,因此多藥耐藥糖蛋白數(shù)量的增多也是化療失敗的原因之一。對于乳腺癌化療耐藥,可以通過逆轉(zhuǎn)MDR來提高化療藥物的敏感性［8］。

Ah R作為腫瘤相關(guān)蛋白和生物治療靶點(diǎn)越來越受到重視［9］。Ah R與多種細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期及腫瘤的生長方式、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān),進(jìn)而有可能影響化療效果［10］。對AhR基因敲除鼠模型的研究顯示,Ah R可影響生物的生殖、生存和生長,而細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)通過外源性Ah R配體激活及干擾會影響細(xì)胞黏附及基質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)(如基質(zhì)金屬蛋白酶)［11］。這些研究結(jié)果都支持AhR可能通過影響細(xì)胞間黏附、基質(zhì)代謝而調(diào)整細(xì)胞行為及信號反應(yīng)。而細(xì)胞外黏附、基質(zhì)降解和基底膜破壞是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要環(huán)節(jié)。盡管Ah R在實(shí)體瘤中的研究已經(jīng)逐步開展,但是Ah R在人類乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的功能仍不清楚。Ah R不僅在人類乳腺癌組織中高表達(dá),動物實(shí)驗(yàn)也表明乳腺不同發(fā)育時(shí)期的Ah R配體TCDD暴露決定了患乳腺癌的危險(xiǎn)性［12］。這些現(xiàn)象均表明Ah R在乳腺癌進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用。此外,Ah R與雌激素受體(estrogen receptor,ER)之間存在抑制性交互應(yīng)答(inhibitory Ah R-ER crosstalk),從而發(fā)揮抗雌激素效應(yīng)［13］。其機(jī)制可能為Ah R被外源性配體激活后發(fā)生Ah R-ER相互作用,引起ERα降解,進(jìn)而抑制雌激素誘導(dǎo)的c-fos轉(zhuǎn)錄,并引起編碼組織蛋白酶D(cathepsin D)、p27和BRCA1等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)［14］。

我們通過組織芯片觀察到,在乳腺癌組織及乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Ah R表達(dá)明顯高于正常乳腺組織,而在乳腺癌與乳腺轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間未見明顯差異。本研究未觀察到Ah R與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系,下一步將通過擴(kuò)展樣本量及分層分析,以期在臨床病理方面有所發(fā)現(xiàn)。經(jīng)基因及蛋白檢測證實(shí)乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADM中Ah R呈高表達(dá)。通過siRNA特異性抑制Ah R基因,MCF-7/ADM的細(xì)胞增殖受到抑制,其對阿霉素的反應(yīng)性明顯增強(qiáng),耐藥性在一定程度上得到逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)說明Ah R在乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥方面存在一定作用,推測機(jī)制除了與Ah R對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用有關(guān)以外,還可能與MDR等對抗阿霉素藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。曾有報(bào)道在小鼠肝癌模型中Ah R與P53介導(dǎo)的多藥耐藥基因MDR1相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)siRNA抑制Ah R基因表達(dá)的可行性,為進(jìn)一步開展將AhR作為乳腺癌阿霉素增敏新靶點(diǎn)的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ Jelly ND,Hussain II,Eremin J,et al.The stem cell factor antibody enhances the chemotherapeutic effect of adriamycin on chemoresistant breast cancer cells［J］. Cancer Cell Int,2012,12(1)：21-28.

［2］ Vezina CM,Lin TM,Peterson RE.AHR signaling in prostate growth,morphogenesis,and disease［J］.Biochem Pharmacol,2009,77(4)：566-576.

［3］ Liu Z,Wu X,Zhang F,et al.AhR expression is increased in hepatocellular carcinoma［J］.J Mol Histol,2013,44 (4)：455-461.

［4］ Wang K,Li Y,Jiang YZ,et al.An endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand inhibits proliferation and migration of human ovarian cancer cells［J］.Cancer Lett, 2013,9(3)：153-155.

［5］ Kang JH,Song KH,Jeong KC,et al.Involvement of Cox-2 in the metastatic potential of chemotherapy-resistant breast cancer cells［J］.BMC Cancer,2011,4(11)：334 -340.

［6］ Kanagasabai R,Krishnamurthy K,Druhan LJ,et al. Forced expression of heat shock protein 27(Hsp27) reverses P-glycoprotein(ABCB1)-mediated drug efflux and MDR1 gene expression in adriamycin-resistant human breast cancer cells［J］.Biol Chem.J Biol Chem,2011,286 (38)：33289-33300.

［7］ Januchowski R,Wojtowicz K,Sujka-Kordowska P,et al. MDR gene expression analysis of six drug-resistant ovarian cancer cell lines［J］.Biomed Res Int,2013,24(7)：63-69.

［8］ Amiri-Kordestani L,Basseville A,Kurdziel K,et al. Targeting MDR in breast and lung cancer：discriminating its potential importance from the failure of drug resistance reversal studies［J］.Drug Resist Up dat,2012,15(1-2)：50-61.

［9］ Tiong CT,Chen C,Zhang SJ,et al.A novel prenylflavone restricts breast cancer cell growth through AhR-mediated destabilization of ERαprotein［J］.Carcinogenesis,2012,33 (5)：1089-1097.

［10］ Hayes JD,Dinkova-Kostova AT,Mc Mahon M.Cross-talk between transcription factors Ah R and Nrf2：lessons for cancer chemoprevention from dioxin［J］.Toxicol Sci, 2009,111(2)：199-201.

［11］ Kung T,Murphy KA,White LA,et al.The aryl hydrocarbon receptor(AhR)pathway as a regulatory pathway for cell adhesion and matrix metabolism［J］. Biochem Pharmacol,2009,77(4)：536-546.

［12］ Wang T,Wyrick KL,Meadows GG,et al.Activation of the aryl hydrocarbon receptor by TCDD inhibits mammary tumor metastasis in a syngeneic mouse model of breast cancer［J］.Toxicol Sci,2011,124(2)：291-298.

［13］ Labrecque MP,Takhar MK,Hollingshead BD,et al. Distinct roles for aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator and ah receptor in estrogen-mediated signaling in human cancer cell lines［J］.PLoSOne,2012,7 (1)：131-136.

［14］ Perdew GH,Hollingshead BD,Dinatale BC,et al. Estrogen receptor expression is required for low-dose resveratrol-mediated repression of aryl hydrocarbon receptor activity［J］.J Pharmacol Exp Ther,2010,335 (2)：273-283.

Aryl hydrocarbon receptor（AhR）expression in breast cancer tissues and its association with adriamycin chemotherapy resistance

LI Zheng-dong1,YANG Xin-wei2,CHENG Xiao-lin1,ZHUANG Zhi-gang1,TONG Xiao-wen3△
(1Department of Breast Surgery,First Maternal and Infant Healthcare Hospital,Tongji University,Shanghai 200040,China；2Department of Surgery of TCM,Municipal Hospital of Shanghai Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China；3Department of Gynaecology and Obstetrics,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China)

Objective To investigate both the expression of aryl hydrocarbon receptor(Ah R)in breast cancer tissues and its association with adriamycin chemotherapy resistance.MethodsAh R expression was observed by immunohistochemical staining in 50 specimens of breast cancer containing 40 cases of metastasis lymph nodes and 10 cases of normal breast tissues.Breast cancer cell line MCF-7/ADR with Ah R high expression was transfected by the Ah R-siRNA liposome vector.The expression of Ah R mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot after transfection.Adriamycin sensitivity of breast cancer cells before and after transfection was determined by proliferation test,MTT.ResultsAh R in immunohistochemical staining was expressed in 82%(46/ 50)breast cancer tissue,in 92.5%(37/40)metastasis lymph nodes,and in 10%(1/10)normal breast tissue.AhR expression in normal breast tissues was significantly lower than that in breast cancers and metastasis lymph nodes(P＜0.05).PCR and Western blot results showed that expression of AhR gene and protein in breast cancer cell line MCF-7/ADR was decreased 24 hours later after Ah R gene silencied by liposome transfection.The proliferation of breast cancer cell MCF-7/ADR was significantly inhibited after Ah R gene was silenced.MTT showed the inhibition rate of cell proliferation was up to 52%at 48 hours.Median effective concentration(IC50)to adriamycin was decreased from(18.2±0.9) μmol/L to(8.4±1.1)μmol/L(P＜0.05)before and after AhR-silenced in breast cancer cells.ConclusionsAhR-siRNA can effectively inhibit the expression of AhR gene and reduce the proliferation of breast cancer cell.Ah R plays a role in adriamycin resistant process,so that Ah R silencing can partly reverse adriamycin resistant in breast cancer.

breast cancer； RNA interference； chemotherapy resistance； adriamycin

R 735.9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.015

2013-08-27；編輯：王蔚)

上海市科委資助課題(134119a7900)

△Corresponding author E-mail：xiaowen_tong@yahoo.com

*This work was supported by Shanghai Municipal Science and Technology Commission Foundation(134119a7900).