負(fù)載輻射凋亡MB49腫瘤細(xì)胞抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）疫苗對(duì)小鼠膀胱癌的抑制作用

謝雪鋒 侯劍剛陳 剛丁 強(qiáng)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院泌尿科 上海 201508；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科研究所 上海 200040)

負(fù)載輻射凋亡MB49腫瘤細(xì)胞抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）疫苗對(duì)小鼠膀胱癌的抑制作用

謝雪鋒 侯劍剛2△陳 剛1丁 強(qiáng)2

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院泌尿科 上海 201508；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科研究所 上海 200040)

目的研究輻射凋亡MB49腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)疫苗的制備及對(duì)C57BL/6小鼠體內(nèi)膀胱腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)。方法采用輻射法獲取MB49細(xì)胞抗原并用其致敏骨髓來(lái)源的DC來(lái)制備DC疫苗。用MB49小鼠膀胱癌細(xì)胞建立荷瘤動(dòng)物模型,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,于腫瘤細(xì)胞接種后第7、14天給予相應(yīng)DC疫苗治療或者PBS,每組分為2個(gè)亞組,分別用于測(cè)量瘤質(zhì)量、體積及用于觀察荷瘤小鼠存活情況。結(jié)果

樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)； 膀胱腫瘤； 疫苗； MB49細(xì)胞； 小鼠

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC),能有效激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答并誘導(dǎo)特異性細(xì)胞

毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)生成。在我國(guó),膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率居全身腫瘤的第5位,其中移行細(xì)胞癌占95%。利用DC疫苗接種宿主,誘導(dǎo)或增強(qiáng)宿主防御功能,提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的特異殺傷能力,已成為晚期膀胱癌免疫治療中的研究熱點(diǎn)。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)MB49細(xì)胞來(lái)源于通過(guò)致癌物誘發(fā)C57BL/6雌性小鼠的膀胱移行細(xì)胞癌(復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院泌尿外科研究所提供)。細(xì)胞培養(yǎng)液為10%胎牛血清、1%盤(pán)尼西林/鏈霉素及含0.1%丙酸鈉的RPMI-1640培養(yǎng)液。細(xì)胞在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用C57BL/6雌性小鼠,4～6周齡,體質(zhì)量17～20 g,飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中。

骨髓來(lái)源DC的制備及鑒定DC細(xì)胞提取方法主要參照Inaba的方法。取6周齡健康雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠,處死后取脛骨和股骨,1 m L注射器抽取無(wú)菌預(yù)冷PBS沖洗骨髓腔；經(jīng)200孔單細(xì)胞過(guò)濾鋼篩過(guò)濾,收集濾液,161×g離心5 min,棄上清；加40 g/L的Tris-NH4Cl溶液1 m L重懸細(xì)胞團(tuán),反應(yīng)2 min,161×g離心5 min,去除裂解之紅細(xì)胞,棄上清,PBS洗滌2次,每次5 min。細(xì)胞團(tuán)重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,使細(xì)胞密度達(dá)到1.5×106/m L轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔2 m L,培養(yǎng)24 h后,PBS洗滌2次,去除未貼壁細(xì)胞,換用含重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(10μg/L)和重組小鼠IL-4(5μg/L)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

采用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞。將收集的細(xì)胞(密度5×105/m L)置于含2μg單抗(CD11c-APC、CD11b-PE、CDI-A-PE、CD80-PE、CD46-PE)的BSA-PBS中,4℃孵育30 min,PBS洗滌2次,加FITC熒光標(biāo)記的羊抗大鼠IgG,4℃孵育30 min, PBS洗滌2次,重懸于含1%多聚甲醛的PBS中,進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACS Becton-Dickenson)檢測(cè)。

腫瘤細(xì)胞的照射和凋亡測(cè)定為了獲得凋亡的腫瘤細(xì)胞,我們收集了培養(yǎng)中的MB49細(xì)胞,制成密度為1×107/m L的單細(xì)胞懸液,然后用100 Gy X線照射(Faxitron CP-160)［1］。經(jīng)過(guò)照射的細(xì)胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng),每天通過(guò)Annexin V-FITC和PI染色后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞的比例。

腫瘤細(xì)胞抗原的負(fù)載經(jīng)過(guò)照射的MB49細(xì)胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)3天,以1∶1的比例和密度為1×106/mL的未成熟DC混合培養(yǎng)24 h于實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組用LPS刺激的未成熟DC細(xì)胞。

DC疫苗的保護(hù)作用研究C57BL/6雌性小鼠40只,隨機(jī)分為4組,分別皮下注射PBS、未成熟DC細(xì)胞(im-DC)、LPS促熟的DC(LPS-DC)及經(jīng)過(guò)照射含有凋亡MB49細(xì)胞共同培養(yǎng)的DC細(xì)胞(MB49-DC)。7天后再重復(fù)接種1次。第2次接種的7天后,皮下接種MB49腫瘤細(xì)胞。每組分為2個(gè)亞組,分別測(cè)量腫瘤體積,并觀察荷瘤小鼠的存活情況。

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以x—±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

通過(guò)體外培養(yǎng)可以獲得大量DC細(xì)胞骨髓來(lái)源的干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化成具有免疫效應(yīng)的DC。為了研究負(fù)載腫瘤抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng),需要足夠量的處于同一成熟水平的DC細(xì)胞。我們首先在培養(yǎng)液中加入IL-4和GM-CSF,以體外擴(kuò)增小鼠骨髓來(lái)源的干細(xì)胞(圖1)。擴(kuò)增到第5天,檢測(cè)表面抗體顯示CD11c高表達(dá),但是CD80、CD86及I-A低表達(dá),提示為未成熟DC細(xì)胞。加入LPS共同培養(yǎng)后第7天,檢測(cè)CD80、CD86及I-A,提示為DC細(xì)胞成熟(圖2)。

X線照射后獲得凋亡的腫瘤細(xì)胞為了獲得最佳的凋亡細(xì)胞數(shù),每天用流式細(xì)胞儀測(cè)定經(jīng)過(guò)照射并用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,結(jié)果顯示在第3天細(xì)胞凋亡達(dá)到最佳數(shù)目(圖3)。

凋亡腫瘤細(xì)胞和未成熟DC細(xì)胞共培養(yǎng)獲得成熟DC細(xì)胞培養(yǎng)至第5天的未成熟DC和經(jīng)照射及無(wú)血清培養(yǎng)的DC共培養(yǎng)1天后,流式細(xì)胞測(cè)定顯示成為成熟DC細(xì)胞(圖4)。

DC疫苗的保護(hù)作用為了檢測(cè)負(fù)載了特殊腫瘤抗原的DC細(xì)胞是否具有疫苗功能,我們進(jìn)行了皮下腫瘤模型［1］的抑制實(shí)驗(yàn)。單純注射PBS后,腫瘤生長(zhǎng)速度快,且小鼠很快出現(xiàn)死亡；注射未成熟DC及LPS-DC后,腫瘤生長(zhǎng)速度有所減慢,但最終也導(dǎo)致小鼠全部死亡(圖5)；注射MB49-DC后,腫瘤生長(zhǎng)速度緩慢,且有2只小鼠出現(xiàn)無(wú)瘤存活(圖6)。

討 論

DC是目前所知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,DC可在其分布位置上捕獲、加工抗原,遷移到淋巴器官中激活T淋巴細(xì)胞,尤其是初始T細(xì)胞(naive T cells)和靜息T細(xì)胞(resting T cells)。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫特別是CTL在機(jī)體抗腫瘤和抗感染中起到重要作用［2］,利用負(fù)載相關(guān)抗原的DC作為疫苗進(jìn)行腫瘤生物治療大有前景［3］。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),用不同形式的腫瘤抗原體外沖擊致敏DC后,可以產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤免疫,并能抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,目前一些體內(nèi)和臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行中［4-5］。在對(duì)腫瘤疫苗的探索中,研究人員采用多種策略研制DC瘤苗,以激發(fā)抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答,主要包括負(fù)載腫瘤抗原的DC、腫瘤抗原致敏的DC和腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染的DC等［6］。用腫瘤細(xì)胞裂解物致敏的DC疫苗能誘導(dǎo)有效的CTL反應(yīng),裂解腫瘤細(xì)胞,并能分泌高水平的干擾素γ(interferon,IFN)［7］。然而,細(xì)胞性抗原因含有多種非腫瘤相關(guān)抗原且抗原性差。而全細(xì)胞性抗原具有多種抗原表位,可誘導(dǎo)針對(duì)不同抗原決定簇的CTL克隆,更有利于對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊。Fry等［8］研究表明,相對(duì)于其他方法,腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)照射后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,并與未成熟DC共同培養(yǎng),未成熟DC可以吞噬凋亡體,并攝取、加工和提呈腫瘤抗原,從而能極大地提高DC的抗腫瘤活性。Hoffmann等［9］認(rèn)為,使用凋亡細(xì)胞比使用裂解物對(duì)產(chǎn)生自體CD8+CTL更有效。

我們的研究提示,通過(guò)體外培養(yǎng)可以獲得大量高質(zhì)量的DC,為DC治療提供了可能性。但是未成熟DC不具有疫苗作用而達(dá)不到治療效果。利用LPS誘導(dǎo)的成熟DC因?yàn)闆](méi)有呈遞腫瘤抗原,同樣沒(méi)有疫苗作用。

經(jīng)過(guò)射線照射后的腫瘤細(xì)胞可以檢測(cè)到大量凋亡細(xì)胞。一方面,射線利用其穿透力,使腫瘤細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生電離效應(yīng),破壞其DNA結(jié)構(gòu),抑制或殺死腫瘤細(xì)胞；另一方面,射線通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放HMGB-1、HSP70等內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號(hào)”而提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性,同時(shí)會(huì)上調(diào)MHC-1和ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達(dá),進(jìn)而趨化免疫細(xì)胞,并激活宿主固有免疫應(yīng)答甚至適應(yīng)性免疫應(yīng)答。凋亡的腫瘤細(xì)胞可作為抗原信號(hào)誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。另外,DC吞噬凋亡細(xì)胞后出現(xiàn)成熟反應(yīng),上調(diào)趨化因子、細(xì)胞因子和共刺激分子。Albert等［10］認(rèn)為,DC與凋亡細(xì)胞共孵育可產(chǎn)生腫瘤特異性CTL,而壞死細(xì)胞不可以。

我們的實(shí)驗(yàn)提示,經(jīng)射線照射后腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到大量調(diào)亡細(xì)胞,其與未成熟DC共孵育后,可以產(chǎn)生高純度的成熟DC,利用調(diào)亡的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟DC具有疫苗作用。本研究表明,負(fù)載輻射凋亡腫瘤細(xì)胞的DC疫苗對(duì)C57BL/6小鼠膀胱腫瘤具有腫瘤抑制效應(yīng),并能延長(zhǎng)小鼠生存期。

［1］ 侯劍剛,徐可,方祖軍,等.應(yīng)用MB49細(xì)胞建立三種膀胱癌模型［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,27(6)：840-841.

［2］ Morel PA,Turner MS.Designing the optimal vaccine：the importance of cytokines and dendritic cells［J］.Open Vaccine J,2010,3：7-17.

［3］ Koido S,Homma S,Hara E,et al.Regulation of tumor immunity by tumor/dendritic cell fusions［J］.Clin Dev Immunol,2010：516768.

［4］ von Euw EM,Barrio MM,Furman D,et al.A phase I clinical study of vaccination of melanoma patients with dendritic cells loaded with allogeneic apoptotic/necrotic melanoma cells.Analysis of toxicity and immune response to the vaccine and of IL-10-1082 promoter genotype as predictor of disease progression［J］.J Transl Med,2008, 6：6.

［5］ Steinman RM,Pope M.Exploiting dendritic cells to improve vaccine efficacy［J］.Clin Invest,2002,109(12)：1519-1526.

［6］ Yanofsky VR,Mitsui H,Felsen D,et al.Understanding dendritic cells and their role in cutaneous carcinoma and cancer immunotherapy［J］.Clin Dev Immunol, 2013：624123.

［7］ Li YL,Wu YG,Wang YQ,et al.Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor lysates induce anti-tumor immunity against gastric cancer ex vivo［J］.World J Gastroenterol,2008,14(46)：7127-7132.

［8］ Fry TJ,Shand JL,Milliron M,et al.Antigen loading of DCs with irradiated apoptotic tumor cells induces improved anti-tumor immunity compared to other approaches［J］.Cancer Immunol Immunother,2009,58 (8)：1257-1264.

［9］ Hoffmann TK,Meidenbauer N,Dworacki G,et al. Generation of tumor-specific T-lymphocytes by crosspriming with human dendritic cells ingesting apoptotic tumor cells［J］.Cancer Res,2000,60(13)：3542-3549.

［10］ Albert ML,Jegathesan M,Darnell RB.Dendritic cell maturation is required for the cross-tolerization of CD8+ T cells［J］.Nat Immunol,2001,2(11)：1010-1017.

Inhibitory effects of dendritic cell（DC）vaccine loading antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells against bladder cancer cells in mice

XIE Xue-feng1,HOU Jian-gang2△,CHEN Gang1,DING Qiang2
(1Department of Urology,Jinshan Hospital,Fudan University,Shanghai 201508,China；
2Institute of Urology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To investigate the effects of dendritic cell(DC)vaccine sensitized by antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells on the treatment of bladder cancer in mice.MethodsMB49 antigen was obtained by irradiation and then sensitized bone marrow derived DC(BM-DC)to establish DC vaccine. Mice bearing bladder cancer were divided into DC group and control group.On the 7thand 14thday after subcutaneous of tumor cell,DC group was injected DC vaccine,and the control group was injected PBS.Each group was divided into two subgroups in order to measure tumor mass and volume and to observe survival condition of mice.ResultsThe average mass and volume of tumors in mice of DC group were significantly higher than those of the control group(P＜0.01),which also had longer survival period.Two mice in DC group survived without tumor for 30 days.Although they were injected MB49 cells for the second time,there was no tumor growth in 30 days.ConclusionsDC vaccine loading antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells can inhibit the growth of MB49 cells in vivo.

dendritic cell(DC)； bladder tumor； vaccine； MB49 cells； mice

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.014

2013-03-28；編輯：王蔚)

△Corresponding author E-mail：hou_jiangang@hotmail.com

負(fù)載輻射凋亡腫瘤細(xì)胞DC疫苗的實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠,其腫瘤的平均體積和平均質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),生存期長(zhǎng)于對(duì)照組。DC疫苗實(shí)驗(yàn)組中有2只小鼠30天內(nèi)無(wú)腫瘤生長(zhǎng),再次皮下接種MB49細(xì)胞觀察30天仍無(wú)腫瘤發(fā)生。結(jié)論負(fù)載輻射凋亡腫瘤細(xì)胞的DC疫苗對(duì)膀胱腫瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效應(yīng)和延長(zhǎng)生存期的作用。