針刺對(duì)缺血腦組織谷氨酸含量及其代謝型受體5mRNA表達(dá)水平影響的實(shí)驗(yàn)研究

趙海軍 王媛 盧巖 韓冰冰 李燕，2 王世軍

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

針刺對(duì)缺血腦組織谷氨酸含量及其代謝型受體5mRNA表達(dá)水平影響的實(shí)驗(yàn)研究

趙海軍1王媛1盧巖1韓冰冰1李燕1，2王世軍1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

目的：觀察針刺對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠缺血腦組織谷氨酸含量及其代謝型受體5（metabotropic glutamate receptor5，mGluR5）mRNA表達(dá)水平的影響。方法：采用線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、曲池組、內(nèi)關(guān)組及地機(jī)組，并設(shè)置假手術(shù)組、空白組，每組6只。針刺14d后，腦組織取材，利用酶化學(xué)法檢測(cè)缺血腦組織中谷氨酸的含量，利用RT-PCR檢測(cè)mGluR5 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組及空白組相比，內(nèi)關(guān)組、曲池組及模型組大鼠腦組織谷氨酸含量明顯升高；與模型組、地機(jī)組相比，內(nèi)關(guān)組、曲池組大鼠腦組織內(nèi)谷氨酸含量明顯下降。與假手術(shù)組及空白組相比，地機(jī)組及模型組大鼠腦組織mGluR5 mRNA表達(dá)明顯升高；與模型組及地機(jī)組大鼠相比，內(nèi)關(guān)組與曲池組大鼠腦組織mGluR5 mRNA表達(dá)明顯升高。結(jié)論：針刺可降低缺血性腦組織谷氨酸含量，上調(diào)mGluR5 mRNA的表達(dá)水平，從而達(dá)到保護(hù)缺血性腦組織的作用。

腦缺血 針刺療法 谷氨酸 mGluR5

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性氨基酸，在突觸興奮傳遞中及神經(jīng)元生理功能方面具有重要的作用，同時(shí)它又具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，參與了缺血性腦中風(fēng)時(shí)神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)損傷的病理生理過程。有研究報(bào)道，其代謝型受體5（mGluR5）亦與該過程有關(guān)。因此，我們擬從缺血性腦組織谷氨酸含量及mGluR5mRNA表達(dá)方面進(jìn)行研究，檢測(cè)針刺對(duì)腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型大鼠上述指標(biāo)的影響，進(jìn)而探討針刺對(duì)缺血性腦中風(fēng)的保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SPF級(jí)Wistar大鼠36只，體重（220± 20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。SPF級(jí)大鼠飼料購自北京科澳協(xié)力公司，合格證號(hào)：SUXK（京）2009-0012。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑谷氨酸測(cè)定試劑盒，批號(hào)A074，購自南京建成生物工程研究所；蛋白含量測(cè)定試劑盒，批號(hào)A045-2，購自南京建成生物工程研究所。Trizol及RT-PCR試劑盒由Invitrogen（美國）公司生產(chǎn)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器GS-15R型高速低溫離心機(jī)，Beckman；UV-7504型單光束紫外可見光分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；7500 Fast型qPCR儀，Applied biosystems公司；EPS300型電泳儀，Tanon公司；2500型凝膠成像儀，Tanon公司。韓式電針儀，南京濟(jì)生醫(yī)療技術(shù)有限公司；I5獨(dú)立通風(fēng)大鼠飼養(yǎng)籠，蘇州蘇杭技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.4 引物合成及序列mGluR5及GAPDH上下游引物委托北京信利來科技有限公司合成，mGluR5上游引物5'-GCAGGGAGCTCTGCTACATTAT-3'，下游引物3'-TGGGCTTCTTGGTACAGATTTT-5'；GAPDH上游引物5'-CATTGTCACCAACTGGGACGATA-3'，下游引物3'-GGAGGCTACGTACATGGCTG-5'。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組采用文獻(xiàn)[1]記載的方法進(jìn)行MCAO模型復(fù)制及假手術(shù)操作，并在大鼠蘇醒后參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行神經(jīng)體征評(píng)分，將評(píng)分為1～3分的大鼠隨機(jī)配伍分組為模型組、內(nèi)關(guān)組、曲池組、地機(jī)組，每組8只。進(jìn)行假手術(shù)操作的大鼠8只為假手術(shù)組。另取8只大鼠作為空白組。

2.2 針刺方法依據(jù)文獻(xiàn)[3]制定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)“內(nèi)關(guān)”、“曲池”及“地機(jī)”取穴，前兩穴作為治療穴，以地機(jī)穴作為無關(guān)對(duì)照穴，該穴定位于陰陵泉穴下3mm，內(nèi)踝最尖部與陰陵泉穴的連線上。針刺內(nèi)關(guān)時(shí)，直刺1mm；針刺曲池和地機(jī)時(shí)，直刺4mm。提插捻轉(zhuǎn)行針后連接在韓式電針儀上。電針儀參數(shù)設(shè)置同參考文獻(xiàn)[2]。造模完成后，于每日上午針刺1次，連續(xù)針刺14d。對(duì)模型組及假手術(shù)組大鼠實(shí)施抓取、捆綁等假針刺操作?？瞻捉M不做任何操作。

2.3 取材末次針刺2h后，處死取腦，于缺血側(cè)大腦中動(dòng)脈起始端前后8mm切一腦片。

2.4 腦組織谷氨酸含量測(cè)定制備腦組織勻漿，用于谷氨酸含量檢測(cè)，檢測(cè)方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 腦組織mGluR5 mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)參照試劑盒說明書提取上述腦組織勻漿的總RNA，核酸測(cè)定儀測(cè)A260/ A280，要求在1.8～2.0之間，以保證RNA純度。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取RNA0.2μg作為反應(yīng)模板，加入RNAase-feee水補(bǔ)充至10μL，加入Oligo（dT）1μL，隨機(jī)引物1μL，以上反應(yīng)體系于65℃反應(yīng)5min，冰浴2min后在該體系中繼續(xù)加入dNTP（10μmol/L）1μL，0.1mol/L DTT 1μL，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，以上反應(yīng)體系在50℃溫育5min。

qPCR擴(kuò)增反應(yīng)：在ABI 7500 Fast qPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系中加入cDNA模板1μL，10倍擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液1μL，MgCl2（25mmol/L）1μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，Sybgreen（20×）1μL，DEPC水12.8μL，聚合酶0.2μL。反應(yīng)體系參數(shù)為95℃2min，94℃20s，60℃20s，72℃30s。PCR擴(kuò)增反應(yīng)共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以空白組作為參照，以GAPDH作為內(nèi)參，以2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用（±s）表示，針刺治療后各組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 針刺對(duì)缺血腦組織谷氨酸含量的影響結(jié)果見表1。模型組缺血腦組織中的谷氨酸含量明顯升高，與假手術(shù)組相比差異具有顯著性（P＜0.05）。內(nèi)關(guān)組與曲池組腦組織內(nèi)谷氨酸含量明顯下降，與模型組及地機(jī)組相比差異具有顯著性（P＜0.05）；內(nèi)關(guān)組與假手術(shù)組及空白組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。

3.2 針刺對(duì)腦缺血組織mGluR5 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見表1。與假手術(shù)組比較，內(nèi)關(guān)組、曲池組及模型組大鼠腦組織mGluR5 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組、地機(jī)組比較，內(nèi)關(guān)組、曲池組大鼠mGluR5 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），內(nèi)關(guān)組又明顯高于曲池組（P＜0.05）；地機(jī)組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠腦組織谷氨酸及mGluR5 mRNA含量比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織谷氨酸及mGluR5 mRNA含量比較（±s）

注：*與假手術(shù)組比較，P＜0.05；▲與模型組比較，P＜0.05；☆與曲池組比較，P＜0.05；#與地機(jī)組比較，P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)（只）谷氨酸含量（μmol/gprot）空白組mGluR5 mRNA含量8 121.17±22.651.00±0.00假手術(shù)組126.56±21.16模型組6221.74±33.81*2.62±0.83*8 1.05±0.05內(nèi)關(guān)組6147.22±34.65▲#5.56±2.49*▲☆#曲池組6188.44±49.42*▲#3.56±2.26▲#地機(jī)組6269.93±51.04*1.99±1.70*

4 討論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性氨基酸，在突觸興奮傳遞及神經(jīng)元生理功能方面具有重要的作用，同時(shí)它又具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。正常條件下，細(xì)胞外谷氨酸水平較低，僅有少量谷氨酸參與信號(hào)傳遞；血腦屏障對(duì)谷氨酸的通透性極低，在腦內(nèi)必須通過糖代謝的中間產(chǎn)物如草酰乙酸、α-酮戊二酸和其他前體經(jīng)多條化學(xué)途徑合成[4]。由于能量代謝紊亂，谷氨酸從胞內(nèi)釋出，進(jìn)入突觸間隙激活谷氨酸受體[5]。從而誘使大量Ca2＋內(nèi)流，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，激活相應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而引發(fā)神經(jīng)毒性[6-7]。同時(shí)，某些氧自由基生成的酶類被激活，氧自由基大量生成，則進(jìn)一步加劇了谷氨酸對(duì)細(xì)胞的損傷[8]。這種損傷使得細(xì)胞膜及線粒體進(jìn)一步損傷，細(xì)胞內(nèi)K＋更多的從細(xì)胞內(nèi)釋出，引起去極化擴(kuò)散即梗死周圍去極化，繼而產(chǎn)生神經(jīng)元過度興奮性損害作用[9]。

谷氨酸主要通過離子型受體（iGluR）和代謝型受體（mGluR）而發(fā)揮作用[10]。其中，mGluR有8種亞型，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、功能及藥理特點(diǎn)可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組。mGluR1和mGluR5共同組成了Ⅰ組，Ⅱ組包括mGluR2和mGluR3，其余亞型組成了Ⅲ組[11]。

目前學(xué)者們對(duì)mGluR5在缺血性腦損傷中作用和機(jī)制的認(rèn)識(shí)并不一致。一部分學(xué)者認(rèn)為，Ⅰ組mGluR可與磷脂酶C結(jié)合，水解磷脂酰肌醇為DAG和IP3產(chǎn)生相應(yīng)效應(yīng)[12]。一方面，DAG在腦缺血時(shí)可被水解形成花生四烯酸，這被認(rèn)為是谷氨酸參與缺血性腦損傷的機(jī)制之一。另一方面，IP3則介導(dǎo)了鈣超載的產(chǎn)生。對(duì)mGluR5的研究發(fā)現(xiàn)，它參與了諸如腦缺血、癡呆等多種疾病過程[13]。

還有研究者發(fā)現(xiàn)，mGluR5的激活可減少缺血組織細(xì)胞凋亡，起保護(hù)作用[14]。陳繼軍等[15]利用mGluR5激動(dòng)劑2-氯-4羥苯基甘氨酸對(duì)創(chuàng)傷性神經(jīng)元損傷作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其可減輕創(chuàng)傷性神經(jīng)元損傷，這種保護(hù)作用可能是由ERK和Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠腦組織谷氨酸濃度升高，其mGluR5 mRNA含量上調(diào)，與空白組及假手術(shù)組相比具有顯著性差異，提示缺血性腦損傷可引起腦組織的谷氨酸含量上升，而mGluR5 mRNA的表達(dá)上調(diào)可能與谷氨酸的誘導(dǎo)有關(guān)。但經(jīng)針刺后，與模型組及地機(jī)組相比，內(nèi)關(guān)組及曲池組大鼠腦組織谷氨酸濃度降低，此時(shí)mGluR5 mRNA表達(dá)水平反而升高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉悅等[16]的研究結(jié)果存在差異，其針刺干預(yù)腦缺血的研究結(jié)果顯示，針刺可以降低缺血腦組織mGluR1、mGluR3、mGluR8的水平，但研究中并沒有包括mGluR5，但包括了Ⅰ組mGluRs的另外一個(gè)亞型即mGluR1，其針刺時(shí)間為24h。本課題的針刺天數(shù)為14d，因此，我們推測(cè)這種差異可能與針刺時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，針刺能夠減輕興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，從而發(fā)揮對(duì)缺血腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用，而表達(dá)升高的mGluR5可能與針刺的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)，但其表達(dá)上調(diào)的機(jī)制及在缺血性腦中風(fēng)中的作用仍需進(jìn)一步研究。

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R743.310.5

A

1672-397X（2014）10-0070-03

趙海軍（1978-），男，博士，講師，研究方向：血瘀證及活血化瘀治法機(jī)制研究。

王世軍，pathology@163.com

2014-05-09

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303053，81373723，81202765，81102652，81072762）；博士點(diǎn)基金博導(dǎo)類資助項(xiàng)目（20103731110006）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010HM079，ZR2009CQ007）