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    清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響

    2014-04-18 07:35:30張偉張雪玲朱雪王國梁孟蕓張莉張曉蕾
    江蘇中醫(yī)藥 2014年7期
    關(guān)鍵詞:肺型光鏡肺纖維化

    張偉張雪玲朱雪王國梁孟蕓張莉張曉蕾

    (1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250011)

    清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響

    張偉1張雪玲2朱雪1王國梁2孟蕓2張莉2張曉蕾2

    (1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250011)

    目的:通過檢測痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠應(yīng)用清金益肺湯后肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平及光鏡下的病理變化,探討清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響。方法:清潔級健康雄性SD大鼠40只,隨機分為5組:空白對照組、痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化模型組(模型組)、中藥治療組(中藥組)、激素治療組(激素組)、中藥加激素治療組(綜合治療組)。采用氣管內(nèi)滴入博來霉素的方法建立肺纖維化模型。造模結(jié)束后第2天氣管內(nèi)滴加脂多糖建立痰熱蘊肺證模型。ELISA法檢測各組大鼠肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平,光鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理改變。結(jié)果:模型組、中藥組、激素組、綜合治療組大鼠肺組織在光鏡下均有肺纖維化的特征性病理改變,但程度有所不同。與空白對照組相比,其余各組大鼠IL-8及TGF-β1的表達(dá)水平均明顯增高;模型組表達(dá)水平明顯高于中藥組、激素組和綜合治療組;綜合治療組明顯低于中藥組和激素組;中藥組和激素組IL-8的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義;激素組TGF-β1水平明顯高于中藥組。結(jié)論:清金益肺湯可改善痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠的呼吸功能、結(jié)構(gòu)改變,并能調(diào)節(jié)免疫,與激素聯(lián)合可增強抗纖維化力度。

    特發(fā)性肺纖維化 痰熱蘊肺 清金益肺湯 IL-8 TGF-β1 病理學(xué) 實驗研究

    特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是一組主要累及肺間質(zhì)、肺泡和(或)細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病,主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性勞力氣促、限制性通氣功能障礙伴彌散功能降低、低氧血癥和影像學(xué)上的雙肺彌漫性病變,其后期多因并發(fā)呼吸衰竭而死亡[1]。本病病因未明,發(fā)病機制亦未完全明確,但已有足夠證據(jù)表明與免疫炎癥損傷有關(guān)。清金益肺湯是在清金化痰湯的基礎(chǔ)上,根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論而確立的有確切臨床療效的方劑,功在清熱化痰、肅肺祛瘀。本實驗擬通過檢測痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠應(yīng)用清金益肺湯后肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平及光鏡下的病理變化,以期探討清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響,為臨床提供實驗依據(jù)。

    1 實驗材料

    1.1 實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠40只,鼠齡10~12周,體重(200±20)g。動物來自山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(魯)20110003。

    1.2 實驗試劑和藥物博來霉素(BLM),invitrogen公司,批號:1134142;脂多糖(LPS),美國Sigma公司;10%水合氯醛,山東大學(xué)齊魯醫(yī)院,批號:20130305;PBS緩沖液(pH=7.4);清金益肺湯(藥物組成:炙麻黃9g,炒白果12g,炒杏仁12g,桔梗12g,川貝12g,浙貝12g,黃芩12g,川芎12g,梔子12g,桑白皮12g,知母12g,瓜蔞30g,金銀花30g,清半夏9g,丹參18g,蒲公英30g,蜈蚣2條,生甘草6g),煎液由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制備;潑尼松片,天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司,批號:20130123。

    1.3主要儀器和設(shè)備AE200電子分析天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;微量高速離心機(國產(chǎn)),型號:TG16W;Labsystems Multiskan MS酶標(biāo)儀(芬蘭),型號:352;Thermo Labsystems洗板機(芬蘭),型號:AC8;隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產(chǎn)),型號:GNP-9080;病理圖像分析(CX41-32rfl,OLYMPUS);美國GATAN CCD圖像處理系統(tǒng)。

    2 實驗方法

    2.1 分組與造模大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,采用隨機數(shù)字表法分為5組:空白對照組(空白組)、痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化模型組(模型組)、中藥治療組(中藥組)、激素治療組(激素組)、中藥加激素治療組(綜合治療組)。除空白組外,其余各組大鼠參照Szapiel[2]的方法造模。試驗第1天,在室溫環(huán)境下,將大鼠逐一稱質(zhì)量,按0.4mL/100g體質(zhì)量腹腔注射濃度為10%水合氯醛溶液,待大鼠麻醉后,將其固定于解剖臺上,頭低位暴露聲門,將16號靜脈套管針沿氣管走行快速插入氣管,拔出針芯,接1mL注射器,1s內(nèi)注入博萊霉素A5藥液(5mg/kg),左右旋轉(zhuǎn)鼠板,使博萊霉素A5藥液均勻分布于兩肺,制成肺纖維化模型。試驗第3天將大鼠麻醉,暴露氣管,一次性注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1g/L的脂多糖0.2mL/200g,將大鼠直立,左右旋轉(zhuǎn),使脂多糖在肺內(nèi)均勻分布,造成痰熱蘊肺證模型。[3-4]

    2.2 給藥方法造模完成后,于實驗第5天開始,中藥組大鼠給予中藥煎液10mL/kg灌胃,激素組大鼠用強的松(3mg/kg)和生理鹽水的混合制劑10mL/kg灌胃,綜合治療組大鼠用中藥煎劑10m L/kg加強的松10mL/kg灌胃,頻次均為每天1次,灌胃14d??瞻?、模型組正常飲食,不予特殊處理。各組動物分別于實驗第19天處死。大鼠藥物用量根據(jù)公式計算,人服用藥物總量為N,人體重量按70kg算,大鼠重量為m,則大鼠所需藥量n=N/70×m×6[5]。

    2.3 觀察指標(biāo)及方法

    2.3.1 動物一般情況監(jiān)測每天觀察大鼠的活動度、對外界反應(yīng)的靈敏度、皮毛光澤、口唇鼻毛色澤、體重、飲食、呼吸、死亡等情況。

    2.3.2 ELISA法檢測肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平大鼠麻醉后取出右肺上葉組織200~500mg,制備成10%的勻漿,離心取上清,ELISA法檢測IL-8、TGF-β1的含量。

    2.3.3 光鏡下肺組織病理觀察各組大鼠用10%水合氯醛(0.4mL/100g)麻醉后,取新鮮左肺下葉組織經(jīng)10%中性福爾馬林48h充分固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)4μm切片4張,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。

    3 實驗結(jié)果

    3.1 一般情況空白組大鼠毛發(fā)亮白,有光澤,反應(yīng)靈敏,呼吸平穩(wěn),體重逐日增加,無特殊不良表現(xiàn)。造模后各組大鼠出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)發(fā)黃、凌亂、脫落、缺少光澤,舌質(zhì)暗紅,呼吸喘促,食量減少,體重增幅減輕。中藥組、激素組、綜合治療組大鼠在毛發(fā)、靈敏度等方面均較模型組表現(xiàn)良好,尤以綜合治療組為優(yōu)。治療結(jié)束后,中藥組、激素組、綜合治療組大鼠靈敏度、毛發(fā)光澤度、舌色、呼吸等均較用藥前有明顯改善。

    3.2 各組大鼠肺組織IL-8及TGF-β1表達(dá)水平見表1。

    表1 各組大鼠肺組織IL-8及TGF-β1的表達(dá)水平(±s)ng/L

    表1 各組大鼠肺組織IL-8及TGF-β1的表達(dá)水平(±s)ng/L

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與綜合治療組比較,△△P<0.01;與中藥組比較,▲P<0.05。

    組別動物數(shù)IL-8空白組TGF-β1 8 386.62±7.54143.19±3.05 8 516.58±16.5**綜合治療組8 427.72±8.26**##155.41±4.61**##中藥組8 485.49±16.1**##△△183.28±2.42**##△△激素組8 498.29±8.34**##△△167.77±5.55**##△△▲模型組195.24±5.48**

    3.3 光鏡下各組大鼠肺組織病理改變見圖1??瞻捉M雙肺呈粉紅色,表面光滑,彈性良好;各造模組可見不同程度的點狀出血、灶狀瘀斑,肺臟表面蒼白,體積縮小,硬度增加,表面呈結(jié)節(jié)樣改變??瞻捉M(圖1-K①、K②):肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰,肺泡間隔未見增厚,無水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn),肺泡腔內(nèi)無明顯滲出;模型組(圖1-M①、M②)肺毛細(xì)血管明顯充血、出血,肺泡間隔明顯增寬變形,肺泡壁增厚水腫,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,有大量炎性細(xì)胞浸潤,纖維細(xì)胞和膠原纖維顯著增生;綜合治療組(圖1-H①、H②)支氣管、肺泡間隔輕度水腫,肺毛細(xì)血管無明顯充血、出血,無明顯炎性細(xì)胞滲出;中藥組(圖1-Z①、Z②)肺毛細(xì)血管輕度充血、出血,肺泡壁水腫,肺泡結(jié)構(gòu)接近正常,輕度炎性細(xì)胞浸潤;激素組(圖1-J①、J②)支氣管、肺泡壁中度水腫,有炎性細(xì)胞浸潤表現(xiàn),肺毛細(xì)血管可見輕度充血、出血,成纖維細(xì)胞增多。

    4 討論

    本研究所采用的肺纖維化造模方法源于Szapiel等[2]的方法,痰熱蘊肺證病理模型的建立采用氣管內(nèi)滴入脂多糖的方法,我們過往的研究表明,采用這種方法處理后的模型大鼠,其臨床表現(xiàn)、病理及病理生理改變與人類肺部炎癥病變非常相似[3-4]。我們通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),在給藥后第3天大鼠肺組織纖維化程度最為明顯,而前期動物實驗證實脂多糖給藥后第2天出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)[3]。我們此次實驗中光鏡下病理結(jié)果均符合人類特發(fā)性肺纖維化的病理表現(xiàn),同時又有炎癥存在,說明痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化模型復(fù)制成功。

    目前認(rèn)為,肺纖維化的發(fā)病最初就有成纖維灶的形成,伴或不伴間質(zhì)性炎癥,最終形成肺纖維化[6-7]。且血管的生成在肺纖維化發(fā)生早期可能起重要作用,調(diào)節(jié)過度的血管生成有可能延緩肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程[8]。

    IL-8是一種由肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物活性的細(xì)胞因子。研究表明,IL-8在肺纖維化患者肺組織中中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞狙擊、介質(zhì)釋放等炎癥過程中起關(guān)鍵作用,可作為判斷肺纖維化炎癥程度的指標(biāo)之一[9]。我們認(rèn)為,特發(fā)性肺纖維化痰熱蘊肺型主要表現(xiàn)為炎癥的改變。本實驗中,與空白組比較,模型組IL-8有顯著升高,經(jīng)治療后各組IL-8均明顯降低,以綜合治療組降低最為明顯,中藥組、激素組次之且組間無明顯差異,提示了不管是中藥清金益肺湯還是激素強的松均抑制了肺組織IL-8的表達(dá),減輕了炎癥反應(yīng),激活和調(diào)節(jié)了免疫細(xì)胞,尤以中藥與激素聯(lián)用的效果最著。雖然中藥組和激素組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但是光鏡下我們發(fā)現(xiàn),中藥組大鼠不管是在炎癥浸潤、肺毛細(xì)血管充血還是成纖維細(xì)胞形成方面,都較激素組表現(xiàn)良好,這就說明與強的松相比,清金益肺湯在改善氣道功能、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面有其獨特的優(yōu)勢。同時我們可以看到,單純的中藥或激素雖然對肺纖維化的治療有一定作用,但二者協(xié)同聯(lián)用效果會更好。

    圖1 各組大鼠肺組織病理圖片(×10)

    TGF-β1具有多重的生物學(xué)作用。研究表明,TGF-β1是一種促血管生成因子,可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的成活及VEGF的表達(dá)而促進(jìn)新生血管的生成[10-11],最終導(dǎo)致纖維化。本實驗中,模型組大鼠肺組織TGF-β1的表達(dá)水平與空白組比較明顯升高,表明模型組的肺損害明顯;治療后以綜合治療組肺組織TGF-β1表達(dá)最低,這彰顯了清金益肺湯和激素聯(lián)用的優(yōu)越性;中藥組肺組織TGF-β1表達(dá)低于激素組,且光鏡下中藥組的肺損傷明顯低于激素組,表明清金益肺湯可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)而調(diào)控了細(xì)胞反應(yīng),調(diào)節(jié)了大鼠的免疫功能,減輕了大鼠的肺纖維化。

    目前,特發(fā)性肺纖維化的西醫(yī)治療多采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合細(xì)胞毒藥物。近年來,中醫(yī)界關(guān)于肺纖維化的病機存在諸多爭論,但越來越多的學(xué)者提出血瘀內(nèi)阻貫穿本病始終[12-14]。清金益肺湯是由《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》中所載的清金化痰湯化裁而來。方中蜜麻黃、炒杏仁、炒白果宣肅肺氣,提壺揭蓋;川貝、浙貝、桑白皮之類肅肺清熱,化痰平喘;因該病多見瘀血表現(xiàn),方中加入川芎、丹參之類活血祛瘀;蜈蚣一味更妙,可加強逐瘀之力。本方是經(jīng)臨床和實驗驗證的對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化行之有效的方劑。痰熱蘊肺是肺纖維化的常見證型,在辨證施治中,當(dāng)注重清熱化痰藥與活血祛瘀藥配伍,并聯(lián)用西藥糖皮質(zhì)激素,勢必會收到事半功倍之效。

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    R563.905

    A

    1672-397X(2014)07-0074-03

    張偉(1963-),男,博士,中醫(yī)肺病學(xué)泰山學(xué)者崗位特聘專家,二級教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合呼吸系統(tǒng)疾病的臨床診療及基礎(chǔ)研究。

    張雪玲,zxl89124@126.com

    2013-12-24

    編輯:吳寧

    泰山學(xué)者建設(shè)工程專項經(jīng)費資助項目(ts20110819);山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2011-050)

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