腸鰓類三崎柱頭蟲再生的研究

王 秋，張學成，李進道

（中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島266003）

半索動物腸鰓類廣泛分布于南、北兩半球的大洋沿岸以及深海中，迄今發(fā)現(xiàn)有60～70種。它們大多數為底內動物，營穴居生活，少數種類為底上動物，棲息于海藻或石塊之間。由于形態(tài)構造、胚胎發(fā)育和繁殖方式的特點，在生物進化研究中占有重要的地位。

再生（Regeneration）是動物和植物中常見的生物學現(xiàn)象，指生物體對失去的結構重新自我修復或代替的過程，生物器官或組織損傷后，保留的部分生長出與原來形態(tài)與功能相同的器官或組織的現(xiàn)象。半索動物是一類再生能力較強的動物，其再生和無性生殖較早引起了學者的注意。Spengel在描述腸鰓類一般形態(tài)時，首次提到了腸鰓類具有與無性生殖有密切關系的再生現(xiàn)象[1]。Kuwano發(fā)現(xiàn)三崎柱頭蟲（Balanoglossus misakiensis）具有再生現(xiàn)象[2]。Dawydoff以實驗的方法比較全面的研究了微小舌形蟲（Glossobanlanuss minutus）的再生現(xiàn)象[3]。Gilchrist研究了翼柱頭蟲（Ptychodera）的雙態(tài)性（Dimorphism）和無性繁殖[4]。Morton發(fā)現(xiàn)柱頭蟲（Balanoglossusaustrallensis）也存在無性生殖現(xiàn)象[5]。Tweedell將玉鉤蟲科（Harrimanlidae）科氏長吻蟲（Saccoglossuskowalevlevskii）的蟲體橫切為2段觀察它們的再生現(xiàn)象[6]。Petersv指出：翼柱頭蟲（Ptychodera）、柱頭蟲（Balanoglossus）和舌形蟲（Glossobanlanus）都是以同一模式進行無性生殖[7]。Miyamoto研究了柱頭蟲（Balanoglossussimodensis）蟲體不同斷片的再生現(xiàn)象[8]。

1960年，中國海洋大學生命學院（原山東海洋學院生物系）胚胎學教研室李嘉泳教授指導作者開始了三崎柱頭蟲（Balanoglossusmisakiensis）生殖和發(fā)育的研究。1966年因故工作中斷。在1980年重新開展三崎柱頭蟲生殖和發(fā)育研究的工作時，多次發(fā)現(xiàn)了它們具有再生現(xiàn)象，并做了深入的研究。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

1980—1982 年，每年6～10月，在山東省青島市辛島灣潮間帶采集完整無缺的三崎柱頭蟲（Balanoglossusmisakiensis），柱頭蟲用裝有海水的廣口保溫瓶當日帶回實驗室飼養(yǎng)。

1.2 飼養(yǎng)方法

實驗用柱頭蟲均以直徑25cm，高12cm的圓形水槽進行室內飼養(yǎng)，以采集地區(qū)的沙質基質鋪滿水槽底部（厚度約5～6cm）。水槽內砂質基質上自然生長的底棲硅藻和碎屑作為主要餌料，另投入人工培養(yǎng)的三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）。飼養(yǎng)水溫控制在17～20℃。

1.3 實驗方法

1980年6 月～1982年6月采集的部分三崎柱頭蟲在暫養(yǎng)期間發(fā)生了自切，在上述培養(yǎng)條件下對自切片段的再生進行了觀察，共觀察了6條個體。1981年秋～1982年春對113條柱頭蟲進行了人工手術橫切后的再生實驗。使用剃刀片（或發(fā)縛）對三崎柱頭蟲做橫切手術，橫切手術類型和橫切部位如下：

A型 自蟲體的生殖翼和肝區(qū)之間橫切為2段。手術時確保蟲體后段肝囊的完整。

B型 將蟲體橫切為3段。Ⅰ段包括吻、領、鰓區(qū)及生殖翼；Ⅱ段是肝區(qū)部分；Ⅲ段是肝囊以后的腸和肛門。C型 將蟲體橫切為4段。Ⅰ段包括吻、領、和鰓區(qū)；Ⅱ段是鰓區(qū)后面的生殖翼部分；Ⅲ段是肝囊；Ⅳ段是腸區(qū)和肛門。

切割后的蟲體斷片飼養(yǎng)方法如上所述，對照個體（4例）與實驗個體置于同一條件下飼養(yǎng)。

能夠重建全部失去的器官，恢復完整的個體，并且生活習性和生存能力與母體相同的斷片視為再生個體，否則視為未再生斷片。

2 實驗結果

2.1 自切后再生觀察

1980年6月28 日采集了1條柱頭蟲，雌性，體長約40cm，身體細長柔軟，消化道內充滿沙粒和碎屑，身體表面裹以黏液和沙粒。洞穴呈U字形，深度約15cm，生殖翼不夠豐滿，采集時氣溫為25℃，洞穴內水溫為24℃，打開洞穴時可以嗅到強烈的碘氣味，可能是三碘甲烷氣體[CHI3]。在飼養(yǎng)過程中，蟲體夜間離開洞穴活動，見光后鉆入基質，生殖翼逐漸豐滿。8月底采集地自然環(huán)境條件下柱頭蟲的生殖期已過，但是已經達到了產卵前狀態(tài)的飼養(yǎng)個體沒有排卵。9月2日飼養(yǎng)水溫提升到25℃，由于升溫的刺激，迅速排放了卵子，數小時之內生殖翼中的卵子幾乎全部排光。排卵后的蟲體于9月3日沿著生殖翼的中后部自切為前、后2個段片。前段包含吻、領、鰓區(qū)和生殖翼的一部分，后段包含生殖翼大部、肝囊區(qū)、腸區(qū)和肛門。缺少吻的后段雖然維持生命狀態(tài)直到10月初，但是始終不能鉆入基質，沒有攝食行為，沒有出現(xiàn)再生前端器官的跡象，歷時近1個月解體。前段從自切到開始攝食和開始鉆入基質的時間不足48h，恢復夜間離開洞穴活動，清晨再鉆進基質的生活習性。9月底前段生殖翼的后端發(fā)生了明顯退化，并進行重建（Remodeling）活動。10月底重建的前段生長良好，再生出肝囊和腸，成為完整的個體，生活習性完全恢復了正常，夜出晝伏，攝食積極。后由于室內溫度連續(xù)下降，蟲體活動能力逐漸減弱，鉆進基質耗費的時間愈來愈長，12月初室溫下降到7℃時，蟲體完全失去鉆進基質的能力，在基質表面自切為數段，不久即完全死亡。再生蟲體體長最終達到母體體長的一半，大約20cm。這條柱頭蟲在飼養(yǎng)條件下共生活了156d。

1981年7月2 日采集了另一條柱頭蟲，雄性，體長約35cm。7月4日，蟲體在肝囊的后部邊沿處自切為2個段片。7月5日，前段又沿著生殖翼的后部發(fā)生了自切。7月6日，后部的2個段片死亡。惟有前端的斷片可以鉆入基質，7月底重建再生了后部的肝囊、腸和肛門，恢復了正常生活（見圖1）。10月15日自然死亡，體長約15cm。共生存105d。

圖1 三崎柱頭蟲自切再生蟲體Fig.1 A regenerative body of B.misakiensis by self－cleavage

1981年10月6 日和16日采集的2批柱頭蟲，飼養(yǎng)期間各有1條個體沿著肝囊的前部自切為2個段片。再生情況與上述基本一致，前段能夠重建蟲體失去的后部所有器官，后段未能再生出失去的蟲體前部。

1982年5～6 月間，又觀察到2條自切為2段的個體，再生情況同上述基本一致。

2.2 橫切手術后再生實驗

1981年秋～1982年春對84條柱頭蟲做了A型、B型和C型分類手術橫切實驗，1982年4月對29條柱頭蟲做了C型手術橫切重復實驗（見表1）。

實驗切割的斷片70%能存活20d以上，46%能存活30d以上。各種不同手術類型的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ段片都沒有重建失去的器官和恢復完整的個體，沒有再生能力。

不同手術類型的Ⅰ段片都能不同程度地重建失去的后部器官。能夠重建全部失去的器官，實現(xiàn)再生的比率很高。手術橫切再生的蟲體見圖2。

84條橫切為2段、3段和4段的實驗，Ⅰ段片的再生率分別為44%、59%和52%。29條C型手術橫切為4個段片的重復實驗，Ⅰ段片再生率為17%。包括重復實驗在內的113條試驗蟲體Ⅰ段片的平均再生率為42%。生存30d以上的Ⅰ段片，65%實現(xiàn)了再生。3種不同切割類型的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ斷片均未發(fā)生再生。4例對照個體，在實驗期間均發(fā)生了自切再生，情況如前所述。

3 討論

本文結果表明，三崎柱頭蟲具有吻和領的自切前端機體幾乎都能再生，重建失去的后部器官；具有吻和領的手術橫切斷片重建能力也很強，大約半數能再生缺失器官。生存時間越長的手術斷片，實現(xiàn)再生的可能性越大，生存30d以上的斷片65%可能再生。但是失去吻和領的自切和手術橫切兩者的其它斷片均失去了這種再生能力?？梢姡形呛皖I的前端機體，對三崎柱頭蟲的器官重建、再生個體的重要性。

表1 三崎柱頭蟲橫切斷片成活與再生個體的統(tǒng)計Table 1 Regeneration of transverse parts in Balanoglossusmisakiensis

圖2 三崎柱頭蟲手術橫切再生蟲體Fig.2 A regenerative body of B.misakiensis by operational cleavage

Tweedell[6]以玉鉤蟲科（Harrimanlidae）的科氏長吻蟲（Saccoglossuskowalevlevskii）為材料，將蟲體橫切為2段觀察它們的再生現(xiàn)象。結果隨著斷面自吻部逐步向后移動，后面片斷再生身體前部器官的能力逐漸減弱。當斷面在鰓區(qū)后部時，斷片的再生極性發(fā)生了改變，即后段失去了再生前部器官的能力，而前段的后端卻有較強的再生出身體后部器官的能力。他認為科氏長吻蟲再生極性與切割面的部位有關。Miyamoto[8]將柱頭蟲（Balanoglossussimodensis）橫切為10段，也發(fā)現(xiàn)蟲體不同斷片再生能力不同的現(xiàn)象。

Dawydoff[3]以實驗的方法比較全面的研究了微小舌形蟲（Glossobanlanussminutus）的再生現(xiàn)象。他將蟲體從頭部到尾部切為4段，Ⅰ段為吻和領部，Ⅱ段為鰓、生殖翼部，Ⅲ段為肝囊區(qū)和部分腸區(qū)，Ⅳ段為腸區(qū)和肛門。結果Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ段的前端均再生出吻、領和鰓等器官，第Ⅰ段沒有再生出身體的后部器官。說明微小舌形蟲除了含有吻和領的機體前端沒有再生能力之外，機體其它部位的再生能力具有一致性，即有能力重建缺失的器官、再生出新的個體。

值得注意的是，三崎柱頭蟲的再生極性和微小舌形蟲的再生極性表現(xiàn)出完全不同的分化。三崎柱頭蟲只有含有吻和領部的前部機體能夠重建失去的器官實現(xiàn)再生，機體的其它部位沒有這種能力。這種現(xiàn)象與已經研究過的其它腸鰓類動物[3，6，8]也是不相同的，值得進一步研究。

R9ttinger等[9]綜述了半索動物的發(fā)育，認為這類動物處于動物發(fā)育的十字路口，并且可能成為研究再生現(xiàn)象的模式生物。

4 結論

（1）三崎柱頭蟲與其它腸鰓類相同，有較強的再生能力。

（2）三崎柱頭蟲自切或實驗切割后，具有吻、領及鰓區(qū)的前段蟲體具有再生后部器官恢復完整個體的能力。不具有這些器官的其它斷片則沒有再生能力。

（3）柱頭蟲與舌形蟲相比較，再生能力在性質上具有明顯的差異。

附言：國內柱頭蟲的研究工作始于1930年代。1960年代初進行了生殖生態(tài)研究，獲得了早期胚胎，受到先師童第周先生的重視和支持。1960年代中期工作中斷了。1980年代初期在飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)了柱頭蟲的再生現(xiàn)象，開始對其再生進行研究。這次實驗是國內至今僅有的一次柱頭蟲再生實驗，先后經歷了四代人的努力，歷時三十余年。世界在這方面的研究也極少見。因為蟲體柔軟易斷和營底內生活的習性，完整活體標本不易采集到是研究極少的重要原因之一。唐樂明、王統(tǒng)崗、劉海玲等幫助采得了大量的完整活體標本，錢培元、吳敏寧、管永紅等學生參加了工作，僅致謝意！

[1]Spengel J W.Die Enteropneusten des Golfes von Neapel und der angrenzenden Meeres－Abschnitte[J].Fauna u Flora d Golfes von Neapel Monogr，1893，18：684.

[2]Kuwano H.On a new enteropneust from Misaki，Balanoglossus misakiensissp[J].Annot Zool Jap，1902，4：77－84.

[3]Dawydoff C.Beobachtungen uber Regenerations prozess bei den Enteropneusten[J].Zeitschr Wiss Zool，1909，93：237.

[4]Gilchrist J.Dimorphism and asexual reproduction inPtychodera capensis.J[J].Linnaean Soc，1923，35：393.

[5]Morton J E.The occurrence in New Zealand of the enteropneustBalanoglossusaustrallensis[J].Trans Roy Soc，1950，78：464－466.

[6]Tweedell K S.Regeneration of the enteropneustSacclglossus kawalevskii[J].Biol Bull，1961，120：118－127.

[7]Petersv J A N，Ditadi A S F.Asexual reproduction inGlossobalanuscrozieri（Ptychoderidae，Enteropneusta，Hemichordata）[J].Mar Biol，1971，9：78－85.

[8]Miyamoto N，Saito Y.Morphological characterization of the asexual reproduction in the acorn wormBalanoglossussimodensis[J].Dev Growth Differ，2010，52：615－727.

[9]Eric R9ttinger E，Christopher J，Lowe C J.Evolutionary crossroads in developmental biology：hemichordates[J].Development，2012，139：2463－2475.