慢性乙型肝炎患者血清M65和M30水平與肝纖維化分期的關(guān)系

許丹丹孟冠敏姜 凱龔艷容

（1．浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州 310012；2．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310003）

慢性乙型肝炎患者血清M65和M30水平與肝纖維化分期的關(guān)系

許丹丹1孟冠敏1姜 凱1龔艷容2

（1．浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州 310012；2．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310003）

目的檢測(cè)慢性乙型肝炎病毒感染后血清中M65和M30水平與肝臟繼發(fā)性纖維化病變的關(guān)系。方法選擇150例慢性乙型肝炎患者和100例健康對(duì)照者，檢測(cè)慢性乙型肝炎患者和健康人群血清M65及M30水平，并對(duì)慢性乙型肝炎患者肝臟活檢組織進(jìn)行METAVIR纖維化分級(jí)以及TUNEL檢測(cè)。結(jié)果慢性乙型肝炎患者血清M30水平（277±44.5）U／L和M65水平（520±56.7）U／L均顯著高于健康對(duì)照組M30（95±22.8）U／L，M65（202±45.7）U／L（均P＜0.01）；在慢性乙型肝炎患者中M30及M65水平和肝纖維化有關(guān)，它們?cè)谘褐械臐舛入S著患者肝纖維化程度的加深而升高，肝纖維化F2級(jí)M30（442±67.9）U／L，M65（707±55.1）U／L；F3級(jí)M30（585±51.2）U／L，M65（774±63.2）U／L；F4級(jí)M30（611±42.1）U／L，M65（788± 59.4）U／L顯著高于F0級(jí)M30（223±23.1）U／L，M65（433±34.7）U／L和F1級(jí)M30（242±41.3）U／L，M65（448±39.4）U／L（均P＜0.05）；慢性乙肝患者肝細(xì)胞凋亡指數(shù)隨著肝纖維化程度的提高而增加，分別為F0級(jí)16.3±3.1，F(xiàn)1級(jí)16.9±2.8，F(xiàn)2級(jí)21.3± 3.6，F(xiàn)3級(jí)25.9±3.2，F(xiàn)4級(jí)28.0±3.7。結(jié)論血清M30及M65水平能提示慢性乙型肝炎患者肝纖維化的程度。

慢性乙型肝炎；肝纖維化；M30；M65

臨床研究證實(shí)，丙型肝炎和非酒精性脂肪肝患者中，細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)記物M65和M30的血清水平可以診斷和預(yù)測(cè)肝纖維化分期，且不受炎癥和脂肪肝程度的影響［1］，但對(duì)慢性乙型肝炎患者是否也可起到同樣的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取150例2013年1月～2014年1月被確診為慢性乙型肝炎的患者共150例作為慢性乙型肝炎組，其中男100例，女50例，年齡25～68歲，平均（38.5±11.3）歲，患者感染急性乙型病毒性肝炎病程超過(guò)半年且HBsAg，HBV DNA，HBcIgM有一種以上陽(yáng)性為慢性乙型肝炎［2］；選取健康對(duì)照者100例作為對(duì)照組，其中男56例，女44例，年齡22～67歲，平均（35.5±10.2）歲。乙型肝炎患者的肝活檢標(biāo)本與血清均來(lái)源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院。

1.2 儀器與試劑 M30－Apoptosense ELISA試劑盒及M65－Apoptosense ELISA試劑盒均購(gòu)于瑞典Peviva AB公司；TUNEL試劑盒購(gòu)于瑞士ROCHE公司。

1.3 方法

1.3.1 血清M65及M30水平檢測(cè) 將血清標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品50μL加入反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50μL生物素標(biāo)記抗體37℃孵育1小時(shí)，之后用洗液將孔清洗5次，加入80μL的親和鏈酶素－HRP，37℃溫育30分鐘。用洗液將孔清洗5次后每孔加入底物A、B各 50μL，37℃溫育10分鐘，加入50μL終止液，在酶標(biāo)儀的450nm處讀取吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清中M30及M65的水平。

1.3.2 肝纖維化程度分級(jí) 乙型肝炎患者肝組織活檢由專業(yè)的病理科醫(yī)生進(jìn)行METAVIR纖維化分級(jí)［3］（F0～F4）。F0為無(wú)纖維化；F1為肝門(mén)束擴(kuò)大，但未形成間隔；F2為肝門(mén)束擴(kuò)大，有小的間隔形成；F3為間隔很多，但無(wú)肝硬化；F4為肝硬化。

1.3.3 TUNEL檢測(cè)肝活檢組織凋亡 按肝纖維化程度（F0～F4）每級(jí)隨機(jī)選取5例組織標(biāo)本進(jìn)行TUNEL染色：將標(biāo)本浸入通透液中8～10分鐘（通透液：0.1%TritonX－100溶于0.1%檸檬酸鈉），生理鹽水洗2次，待標(biāo)本干后加50μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃溫育1小時(shí)，生理鹽水洗2次，待標(biāo)本干后加50μL辣根過(guò)氧化物酶抗體于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃溫育30分鐘，生理鹽水洗2次，加80μL DAB底物室溫孵育10分鐘，生理鹽水洗2次，之后用蘇木素復(fù)染幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。典型的陽(yáng)性細(xì)胞核著色，棕黃色或褐黃色。在低倍鏡下（×100）選取細(xì)胞分布均勻的視野，再在高倍鏡下（×400）計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)的百分比，即凋亡指數(shù)（AI）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用（±s）表示，P值計(jì)算采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清M30和M65水平 慢性乙型肝炎組血清M30水平（277±44.5）U／L和M65水平（520± 56.7）U／L均顯著高于對(duì)照組M30（95±22.8）U／L和M65（202±45.7）U／L（P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

表1 兩組血清M30和M65水平比較（±s，U／L）

表1 兩組血清M30和M65水平比較（±s，U／L）

與對(duì)照組比較**P＜0.01

組 別nM30M65對(duì)照組10095±22.8202±45.7慢性乙型肝炎組150277±44.5**520±56.7**

2.2 乙型肝炎患者肝纖維化分級(jí)和血清M30、M65水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)的關(guān)系 慢性乙型肝炎患者肝組織活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同程度的肝纖維化（F0～F4），同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎患者血清M30、M65水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，結(jié)果如表2所示，隨著肝纖維化程度的加深，相應(yīng)的M30、M65水平也上升，同時(shí)M30／M65比值也隨著肝纖維化程度的加深而增加，TUNEL檢測(cè)結(jié)果也顯示了肝細(xì)胞凋亡指數(shù)隨著肝纖維化程度的加深而增加（見(jiàn)第458頁(yè)彩圖1）。不同肝纖維化程度患者M(jìn)30／M65比值與肝細(xì)胞凋亡指數(shù)AI的相關(guān)系數(shù)為0.9957，提示慢性乙型肝炎患者血清的M30／M65水平比值與肝細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)關(guān)系。

表2 肝纖維化分級(jí)與血清M30、M65水平及凋亡指數(shù)比較（±s）

表2 肝纖維化分級(jí)與血清M30、M65水平及凋亡指數(shù)比較（±s）

與肝纖維化分級(jí)F0比較**P＜0.01

肝纖維化分級(jí)nM30（U／L）M65（U／L）M30／M65AI（n＝5，%）F021223±23.1433±34.70.5216.3±3.1 F159242±41.3448±39.40.5416.9±2.8 F234442±67.9**707±55.1**0.63**21.3±3.6**F323585±51.2**774±63.2**0.76**25.9±3.2**F413611±42.1**788±59.4**0.78**28.0±3.7**

3 討 論

乙型肝炎患者肝纖維化的病因來(lái)自于受乙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞組織在機(jī)體的免疫反應(yīng)下死亡，之后又被修復(fù)，在反復(fù)的損傷和修復(fù)刺激下逐漸形成肝纖維化瘢痕，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的進(jìn)展，肝纖維化程度的不斷加深將最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌［4］。因此，準(zhǔn)確地掌握慢性乙肝患者肝纖維化的程度對(duì)于判斷乙肝進(jìn)展的嚴(yán)重程度，確定治療方案以及評(píng)估抗病毒治療的效果有著至關(guān)重要的作用。肝活檢一直以來(lái)都被認(rèn)為是判斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，然而肝活檢作為一種侵入性診斷方法，尤其是當(dāng)需要進(jìn)行反復(fù)穿刺時(shí)，其可能引起的出血并發(fā)癥大大限制了肝活檢的應(yīng)用。另外，肝活檢只取大約1／50000體積的肝組織，如此微量的體積也大大增加了肝活檢結(jié)果可靠程度的局限性［5］。因此，發(fā)展血清學(xué)診斷肝纖維化具有十分重要的意義。

本文發(fā)現(xiàn)相比于正常人，慢性乙型肝炎患者M(jìn)30和M65水平明顯提升，且呈現(xiàn)出不同程度的肝纖維化。M30抗原是肝細(xì)胞凋亡的血清學(xué)指標(biāo)，它只在凋亡的肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)，而不會(huì)出現(xiàn)在活的或壞死的肝細(xì)胞內(nèi)，M30水平已經(jīng)被報(bào)道可以用來(lái)鑒別單純性脂肪肝和脂肪性肝炎，并用來(lái)判斷非酒精脂肪性肝炎的肝纖維化程度［6］。M65抗原則不論在肝細(xì)胞發(fā)生凋亡還是壞死，它都能在血清中被檢測(cè)到［7］。因此，計(jì)算M30與M65的比值對(duì)評(píng)價(jià)肝細(xì)胞凋亡占肝細(xì)胞總死亡的比率有一定的意義，本文結(jié)果表明，隨著肝纖維化程度的增加，M30／M65比值也相應(yīng)增加，且M30／M65比值與肝細(xì)胞凋亡指數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系，提示慢性乙型肝炎患者血清的M30／M65水平比值可以推測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況和肝纖維化情況。通過(guò)聯(lián)合測(cè)定M30與M65水平，并通過(guò)M30與M65比值輔助判斷乙肝患者肝纖維化的程度，對(duì)于乙肝患者的治療和預(yù)后將有十分重要的意義。對(duì)比肝組織活檢，血清學(xué)檢測(cè)乙肝患者肝纖維化，能大大減輕患者的痛苦，并減少并發(fā)癥的發(fā)生。

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