水溫對(duì)日本沼蝦耗氧率及鰓組織CAT、SOD活力的影響

吳一挺，呂敢堂，任夙藝，王志錚，曹 彪

(1.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.舟山市海洋與漁業(yè)局，浙江舟山 316000)

眾所周知，水溫是影響水生動(dòng)物攝食、生長(zhǎng)、代謝等生命活動(dòng)的重要環(huán)境因子，當(dāng)水溫偏離目標(biāo)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物適宜溫度范圍時(shí)，勢(shì)必會(huì)干擾其正常的生命活動(dòng)，甚至危及其存活。因此，探究目標(biāo)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的水溫耐受范圍和適宜范圍對(duì)指導(dǎo)其健康養(yǎng)殖具重要的現(xiàn)實(shí)意義。

日本沼蝦Macrobrachium nipponensis(De Haan,1849)隸屬于十足目Decapoda、長(zhǎng)臂蝦科Palaemonidae、沼蝦屬M(fèi)acrobrachium，系我國(guó)重要的淡水蝦類養(yǎng)殖品種之一，年產(chǎn)量達(dá)20萬t以上[1]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于溫度對(duì)日本沼蝦的影響研究主要涉及能量代謝[2]、攝食[3]、胚胎發(fā)育[4]以及低溫對(duì)耗氧率、排氨率的影響[5]等方面，而有關(guān)水溫對(duì)日本沼蝦存活率、耗氧率與鰓組織CAT、SOD酶活力的影響研究則迄今尚未見報(bào)道。鑒于此，作者在觀察并確認(rèn)日本沼蝦溫度耐受范圍的基礎(chǔ)上，以獲取溫度適宜范圍為主旨，于2010年8－9月在浙江海洋學(xué)院安全養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展了水溫對(duì)日本沼蝦存活、耗氧節(jié)律和鰓組織CAT、SOD酶活力的影響研究，以期為指導(dǎo)日本沼蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)用日本沼蝦購自浙江余姚市青港野生苗種場(chǎng)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即移入若干規(guī)格為80 cm×50 cm×42 cm的白色塑料箱內(nèi)，并選取其中肢體完整、反應(yīng)靈敏、無傷病、規(guī)格相近的健壯個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象(體長(zhǎng) 4.29±0.32 cm、體質(zhì)量 1.80±0.12 g)，停食馴養(yǎng) 2～3 d 后備用。

1.1.2 理化條件

實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng) 48 h 自然曝氣的自來水，pH 7.11±0.07，水溫 24.0±0.2 ℃，DO 7.24±0.14 mg/L，水質(zhì)符合NY 5051－2001無公害食品淡水養(yǎng)殖用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2001)[6]要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溫對(duì)日本沼蝦存活的影響實(shí)驗(yàn)

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定致死閾(0℃和40℃)后，按等差間距設(shè)置 12.5℃、15℃、17.5℃、20℃、22.5℃、25℃、27.5℃、30℃、32.5℃等9個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度。以規(guī)格為55 cm×40 cm×30 cm的塑料箱為實(shí)驗(yàn)容器單元(實(shí)驗(yàn)實(shí)際容器20 L)，以48 h為實(shí)驗(yàn)周期(各實(shí)驗(yàn)梯度組實(shí)驗(yàn)蝦均按±1℃/h過渡至對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)水溫后開始計(jì)時(shí))，采用靜水停食法開展水溫對(duì)日本沼蝦存活的急性影響實(shí)驗(yàn)。每一梯度組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)單元各放實(shí)驗(yàn)蝦10 ind，實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)蝦死亡及存活情況，并及時(shí)撈出死亡個(gè)體，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各梯度實(shí)驗(yàn)蝦的存活數(shù)。

1.2.2 水溫對(duì)日本沼蝦耗氧率的影響實(shí)驗(yàn)

根據(jù) 48 h內(nèi)水溫對(duì)日本沼蝦存活影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)[2－5，7－8]，設(shè)置 22.5 ℃、25 ℃、27.5℃等3個(gè)水溫實(shí)驗(yàn)梯度組(每一梯度組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)單元各放實(shí)驗(yàn)蝦8 ind)，采用流水呼吸室法(流量4.32±0.67 L/h)開展水溫對(duì)日本沼蝦晝夜耗氧率的影響實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前同時(shí)將實(shí)驗(yàn)蝦隨機(jī)放入對(duì)應(yīng)的呼吸室內(nèi)穩(wěn)定1 h后，于00：00起每隔2 h測(cè)定1次進(jìn)、出呼吸室的水溫和DO值，連續(xù)測(cè)定24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用濾紙吸干實(shí)驗(yàn)蝦體表水分并逐一用分析天平(Sartorius BP211D型，精度0.1 mg)稱量。日本沼蝦耗氧率測(cè)定系統(tǒng)同吳一挺等[9]，并采用冰塊和加熱棒維持測(cè)定系統(tǒng)內(nèi)水溫的恒定；水中溶解氧均采用JPSJ－605臺(tái)式溶解氧測(cè)定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定；晝、夜區(qū)間耗氧率的統(tǒng)計(jì)時(shí)段分別設(shè)為06:00至18:00和18:00至次日06:00。

1.2.3 水溫對(duì)日本沼蝦鰓組織SOD、CAT活力的影響實(shí)驗(yàn)

以規(guī)格為80 cm×50 cm×42 cm的塑料箱為實(shí)驗(yàn)容器單元(實(shí)驗(yàn)實(shí)際容器20 L)，設(shè)置22.5℃、25℃、27.5℃等3個(gè)水溫實(shí)驗(yàn)梯度組(每一梯度組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)單元各放實(shí)驗(yàn)蝦20 ind)，采用靜水停食實(shí)驗(yàn)法開展48 h內(nèi)水溫對(duì)日本沼蝦鰓組織SOD、CAT活力的影響實(shí)驗(yàn)。于實(shí)驗(yàn)第12 h、24 h、36 h和48 h分別從各實(shí)驗(yàn)容器單元內(nèi)隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)蝦3 ind，于冰盤上解剖取其鰓組織并準(zhǔn)確稱重，用玻璃勻漿器冰浴充分研磨后，用0.86%生理鹽水制成10%的組織勻漿液，4℃保存?zhèn)錅y(cè)。按南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒、SOD活力測(cè)定試劑盒、CAT活力測(cè)定試劑盒說明書要求依次測(cè)定實(shí)驗(yàn)蝦鰓組織蛋白質(zhì)含量、SOD活力和CAT活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均借助SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組間差異的顯著性檢驗(yàn)均采用LSD多重比較法(a＜0.05視為顯著水平)。

2 結(jié)果

2.1 水溫對(duì)日本沼蝦存活的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)期間12.5℃和32.5℃梯度組實(shí)驗(yàn)蝦對(duì)外界碰觸刺激反應(yīng)均較其它實(shí)驗(yàn)組明顯遲鈍，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)刻它們的死亡率分別為66.7%和56.7%，其中12.5℃梯度組死亡個(gè)體頭胸部附肢大多出現(xiàn)不同程度的脫落現(xiàn)象，但其肢體和鰓色卻均顯正常，32.5℃梯度組死亡個(gè)體頭胸部附肢雖均完好，但均表露肢體變白和鰓色轉(zhuǎn)呈橘黃的癥狀。水溫15～30℃間實(shí)驗(yàn)蝦的存活率均為100%，表明日本沼蝦對(duì)水溫的耐受范圍為15～30℃。

2.2 不同水溫對(duì)日本沼蝦耗氧率的影響

由表1可見，實(shí)驗(yàn)蝦耗氧高峰表露時(shí)段均為04:00－06:00，組內(nèi)耗氧率均呈夜均＞晝均(P＜0.05)，但晝均、夜均及各觀測(cè)時(shí)段耗氧率則均隨水溫升高而顯著增大(P＜0.05)，表明水溫22.5～27.5℃范圍內(nèi)日本沼蝦呼吸節(jié)律并未發(fā)生根本性改變，而呼吸代謝則有隨水溫升高明顯加快的趨勢(shì)。

表1 溫度對(duì)日本沼蝦呼吸耗氧率的影響Tab.1 Daily changes of oxygen consumption of Macrobrachium nipponensis at different temperature

2.3 不同水溫對(duì)日本沼蝦鰓組織SOD和CAT活力的影響

由表2可見，水溫22.5℃和25℃實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦鰓組織SOD活力不僅在時(shí)序變化上步調(diào)一致，即SOD值均表露為第12 h最大，第24 h與第36 h持平，第48 h降至最小，且兩者各觀測(cè)時(shí)刻SOD值間亦無顯著差異(P＞0.05)；水溫27.5℃實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦鰓組織SOD值雖也隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降，但其SOD值卻表露為第12 h最大，第24 h顯著大于第36 h(P＜0.05)，第36 h與第48 h持平，且其各觀測(cè)時(shí)刻SOD值均顯著大于22.5℃和25℃實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，表明25℃為引起實(shí)驗(yàn)蝦鰓組織SOD活力發(fā)生改變的分水嶺。由表3可見，雖各實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦鰓組織CAT活力時(shí)序變化均不顯著(P＞0.05),但各觀測(cè)時(shí)刻CAT值則均隨水溫升高而顯著增大(P＜0.05)，表明在本實(shí)驗(yàn)水溫范圍內(nèi)CAT可作為表征實(shí)驗(yàn)蝦鰓組織代謝強(qiáng)度高低的指標(biāo)酶。

表2 水溫對(duì)日本沼蝦鰓組織SOD活力的影響Tab.2 The SOD activity in Gills of M.nipponense at different temperature

表3 水溫對(duì)日本沼蝦鰓組織CAT活力的影響Tab.3 The CAT activity in Gills of M.nipponense at different temperature

3 討論

3.1 日本沼蝦水溫耐受范圍的確定

本研究中，48 h內(nèi)12.5℃和32.5℃實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦死亡率分別達(dá)66.7%和56.7%，而水溫15～30℃范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)蝦均不出現(xiàn)死亡，表明該蝦的適溫范圍為15～30℃，這與屈忠湘[7]觀察認(rèn)為日本沼蝦適宜水溫為18～30℃的結(jié)果基本相符，而與施正峰等[3]認(rèn)為10～30℃為日本沼蝦正常生長(zhǎng)的水溫范圍有一定出入，可能是由不同地理居群日本沼蝦對(duì)水溫的適應(yīng)性存有差異所致。至于導(dǎo)致12.5℃實(shí)驗(yàn)組死亡個(gè)體大多出現(xiàn)頭胸部附肢脫落，32.5℃實(shí)驗(yàn)組死亡個(gè)體出現(xiàn)肢體和鰓組織色變，以及上述兩實(shí)驗(yàn)組存活個(gè)體對(duì)外界碰觸刺激均較遲鈍的原因與機(jī)理則有待進(jìn)一步研究。

3.2 日本沼蝦最適水溫的確定

鰓作為甲殼動(dòng)物的水－血屏障，具有呼吸、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)等功能[10]，是日本沼蝦新陳代謝的重要場(chǎng)所之一。由此，水溫對(duì)日本沼蝦鰓組織正常生理代謝活動(dòng)的干擾程度可作為判定其適宜水溫的重要依據(jù)。大量研究表明，在溫度耐受范圍內(nèi)，耗氧率可作為表征動(dòng)物新陳代謝速率的基礎(chǔ)性指標(biāo)，SOD和CAT活力可反映動(dòng)物新陳代謝過程中體內(nèi)有害物質(zhì)的積累程度，故由水溫偏離目標(biāo)研究動(dòng)物最適范圍而導(dǎo)致SOD、CAT活力以及耗氧率過高和過低的情形均會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。

由表1可見，雖日本沼蝦在實(shí)驗(yàn)溫度范圍(22.5～27.5℃)內(nèi)其晝均、夜均及各觀測(cè)時(shí)段耗氧率均隨水溫升高而顯著增大(P＜0.05)，但呼吸節(jié)律并未發(fā)生根本性改變，即實(shí)驗(yàn)蝦耗氧高峰表露時(shí)段均為04:00－06:00，組內(nèi)耗氧率均呈夜均＞晝均(P＜0.05)，這一結(jié)果既與水溫10～25℃間日本沼蝦呼吸能耗隨溫度升高而增大的結(jié)果相吻[2]，也與日本沼蝦適宜水溫為18～30℃的觀察結(jié)果相符，即22.5～27.5℃應(yīng)在日本沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的適宜范圍內(nèi)。

由表2可見，22.5℃和25℃實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦鰓組織SOD活力在時(shí)序變化上步調(diào)一致且組間無顯著差異(P＞0.05)，而 27.5 ℃實(shí)驗(yàn)組各觀測(cè)時(shí)刻 SOD 活力均顯著大于 22.5 ℃和 25 ℃實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，且其SOD最低值較它們前置12 h，表明27.5℃對(duì)日本沼蝦鰓組織代謝生理有一定的負(fù)面作用。由表3可見，實(shí)驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)各觀測(cè)時(shí)刻CAT活力均無顯著差異(P＞0.05)，而組間則均隨水溫升高而顯著增大(P＜0.05)，這既表明水溫22.5～27.5℃范圍內(nèi)CAT活力處于正常狀態(tài)，也反映了日本沼蝦鰓組織SOD對(duì)水溫的響應(yīng)較CAT更為靈敏的結(jié)果?；谝陨戏治?，可判定水溫25℃為日本沼蝦最適水溫，這既與施正峰等[3]指出25℃日本沼蝦攝食能量利用率最高，是其生長(zhǎng)的最適溫度的觀點(diǎn)相同，也與饑餓狀態(tài)下日本沼蝦在水溫19～22℃時(shí)的半致死和全致死時(shí)間均顯著長(zhǎng)于25～28℃的結(jié)果相符[8]。

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