兩種鯊魚鰓部真菌菌群的PCR-DGGE分析*

張 翼 穆 軍 馮 妍 閻 松

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兩種鯊魚鰓部真菌菌群的PCR-DGGE分析*

張 翼1, 2穆 軍1, 3①馮 妍1閻 松1

(1. 大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院 大連 116028; 2. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 大連 116024; 3. 浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 舟山 316022)

以提取自東海海域兩種鯊魚(尖吻鯖鯊和噬人鯊)鰓耙組織的總DNA為模板, 對(duì)其真菌菌群rDNA的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離, 電泳圖譜中的7條主要條帶經(jīng)過二次PCR擴(kuò)增后進(jìn)行了克隆測(cè)序。NCBI-BLAST比對(duì)及分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明, 尖吻鯖鯊鰓部真菌菌群的優(yōu)勢(shì)種來自四個(gè)分類單元, 其中一個(gè)來自青霉屬, 三個(gè)來自曲霉屬; 噬人鯊鰓部真菌的優(yōu)勢(shì)種來自四個(gè)分類單元, 其中一種來自青霉屬、兩個(gè)來自梗孢酵母屬、一個(gè)來自枝頂孢屬; 青霉屬為兩種鯊魚鰓部共同的優(yōu)勢(shì)菌; 另外DGGE指紋圖譜顯示還有種類較豐富的劣勢(shì)菌存在。數(shù)據(jù)庫檢索顯示多數(shù)真菌分類單元具有較好的產(chǎn)生生物活性天然產(chǎn)物的潛力。該P(yáng)CR-DGGE分析揭示鯊魚鰓部棲生有較豐富的真菌類群, 它們的代謝產(chǎn)物及其與宿主之間的相互作用還有待深入研究。

鯊魚; 鰓; 真菌菌群; ITS rDNA; 變性梯度凝膠電泳

在海洋動(dòng)植物的體內(nèi)或體表普遍棲生有真菌等各類微生物, 它們與宿主之間存在著共棲、共生或寄生關(guān)系。某些共附生微生物能產(chǎn)生一些具有細(xì)胞毒活性或抗菌活性的化學(xué)物質(zhì), 參與宿主對(duì)外界蟲害、捕食者、污損生物或病原微生物的化學(xué)防御, 提高宿主的環(huán)境適應(yīng)性和生存能力(Haygood, 1999; Armstrong, 2001; Taylor, 2007), 因此成為海洋天然產(chǎn)物化學(xué)研究的焦點(diǎn)資源, 其中共附生真菌因其代謝潛力強(qiáng)大而備受關(guān)注(Bugni, 2004; Saleem, 2007)。但目前國內(nèi)外海洋共附生真菌等藥源微生物的宿主來源主要集中于海綿、紅樹林、海藻等營固著生活的海洋動(dòng)植物, 對(duì)于魚類等營游泳生活的宿主的相關(guān)研究報(bào)道非常少(林永成等, 2003; Bugni, 2004; 周榮麗等, 2008)。

鯊魚是體型較大的魚類, 廣泛分布于各大洋, 也是我國海域主要的軟骨魚類(朱元鼎等, 2001; 張清榕等, 2005)。它們的一些生理特點(diǎn)不同于硬骨魚類, 如沒有鰾, 而僅靠肝臟油脂浮力不足, 因此多數(shù)鯊魚一直在積極游泳靠鰭提供升力以避免下沉, 在游泳時(shí)大流量的海水流經(jīng)鰓裂給鯊魚提供氧氣, 以姥鯊為例, 每小時(shí)須過濾2000m3的海水(孟慶聞等, 1987; Maddalena, 2007; Knickle, 2011), 這非常有利于截獲富集廣泛海域內(nèi)的豐富多樣的海洋微生物。而且鰓組織充足的氧氣、毛細(xì)血管網(wǎng)提供的豐富營養(yǎng)都非常有利于真菌等好氧海洋微生物的棲居生長, 可視為一種“自航式微生物采樣器”, 但目前關(guān)于其藥源微生物的研究報(bào)道非常少(王燦等, 2009)。

眾所周知, 可培養(yǎng)微生物通常只占環(huán)境微生物總數(shù)的冰山一角, 而變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)則可不依賴于傳統(tǒng)的菌株分離培養(yǎng)策略, 可直接揭示樣品中的微生物種類及其組成, 因此也被越來越多地用于研究珊瑚、海綿、海藻等海洋生物宿主中共附生微生物菌群組成(Bourne, 2005; Gao, 2008; Zuccaro, 2008)。由于鯊魚鰓具有較明顯的海洋微生物采集優(yōu)勢(shì), 而其共附生微生物菌群組成的研究尚為空白, 本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析了兩種鯊魚鰓部真菌菌群的組成, 以期對(duì)其生物多樣性提供一個(gè)全景視角, 為進(jìn)一步的藥用真菌資源的開發(fā)及化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

兩種鯊魚鰓樣品于2010年4月取自浙江省樂清市一水產(chǎn)品加工廠剛運(yùn)輸?shù)职兜臇|海海域漁獲的新鮮鯊魚, 使用無菌工具切割鰓耙樣品, 無菌海水沖洗后密封于無菌容器中, 于4°C保存并迅即空運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室, 于超凈工作臺(tái)中用無菌海水沖洗后, 切割為小塊后置于25%無菌甘油凍存液中-70°C密封凍存。取樣時(shí)對(duì)鯊魚拍照并測(cè)量其身體尺寸, 經(jīng)大連自然史博物館魚類學(xué)專家趙永波研究員鑒定分別為尖吻鯖鯊()(本實(shí)驗(yàn)中編號(hào)為A)和噬人鯊() (本實(shí)驗(yàn)中編號(hào)為B)。

1.2 樣品總DNA提取與純化

各取5 g每種鯊魚鰓樣品放入滅菌研缽中, 加入液氮研磨至粉末狀, 轉(zhuǎn)入50 mL離心管中。加入5 mL CTAB提取液(100 mmol/L Tris·Cl, 100 mmol/L EDTA-Na2, 200 mmol/L NaCl, 2% CTAB, pH 8.0), 37°C振蕩45 min。加入20% SDS至終濃度為2%, 65°C水浴2 h。然后用酚-氯仿法完成DNA的提取(Sambrook, 2002)。測(cè)定提取的總DNA濃度, 并用TE稀釋至100 ng/mL。而后使用上海生工UNIQ-10離心柱式膠回收試劑盒對(duì)模板DNA進(jìn)行純化, 最終回收的DNA片段溶于40 μL TE緩沖液, 保存于-20°C備用。

1.3 PCR擴(kuò)增

所用引物真菌ITS1-GC、ITS2-GC序列見表1, 反應(yīng)條件參照Doare-Lebrun(2006)及Gao等(2008)的方法。反應(yīng)體系為50mL總體積, ddH2O 40 μL, 10× Buffer (含2.0 mmol/L MgCl2) 5 μL, dNTP (10 mmol/L) 1mL, 正反引物各1mL (10mmol/L),酶(5 U/mL) 0.25mL, 模板DNA 2mL, 不足部分以ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序: 94°C 5min預(yù)變性; 94°C變性30 s, 54°C退火45 s, 72°C延伸1 min, 一共35個(gè)循環(huán)。最后延伸7 min。取PCR產(chǎn)物各2mL, 1.5%瓊脂糖凝膠加5% Goldview染液, 120 V穩(wěn)壓電泳15 min, 檢查擴(kuò)增效果。

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析及條帶測(cè)序

采用美國Bio-Rad公司D-CodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)A、B樣品進(jìn)行DGGE分析(龍良鯤等, 2005; Gao, 2008)。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%, 變性劑濃度從15%—40% (100%的變性劑為7 mol/L尿素, 40%甲酰胺)。在70 V電壓下, 60°C電泳13 h。而后用超純水沖洗膠, 5% Goldview的染液染色30min, 凝膠成像拍攝圖譜。用潔凈的手術(shù)刀片切取代表性DGGE條帶, 按上海生工UNIQ-10柱式PAGE膠DNA回收試劑盒(SK1135)方法回收, 以回收的DNA片段為模板, 用引物對(duì)ITS1和ITS2(表1)對(duì)其進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)程序同1.3。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳純化, 切膠后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA。使用T4 DNA連接酶將所得DNA片段連接到載體pUCm-T, 用生工SSCS快速一步法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(SK2301), 以藍(lán)白斑法挑選陽性克隆, 每個(gè)條帶取3個(gè)克隆, 培養(yǎng)過夜后使用SK1191 UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA, 并交上海生工生物工程公司使用通用引物M13+/-正反向測(cè)序。所得序列均提交Genbank, 其登錄號(hào)見表2。

1.5 序列比對(duì)及系統(tǒng)樹構(gòu)建

用BLAST 軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。并將序列結(jié)果及從Genbank中下載的相關(guān)種屬真菌的ITS1序列利用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行DNA 序列排列剪切, 使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建NJ樹、UPGMA樹(Thompson, 1997; Tamura, 2007)。結(jié)合BLAST比對(duì)及聚類分析系統(tǒng)樹結(jié)果, 確定優(yōu)勢(shì)條帶所對(duì)應(yīng)的分類單元。

表1 實(shí)驗(yàn)所用真菌引物

Tab.1 Fungal primers used in this experiment

GC: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

如圖1所示, 使用真菌rDNA通用引物對(duì)ITS1-GC、ITS2-GC從兩種鯊魚的鰓組織中都擴(kuò)增出了較明亮的條帶, 其長度約為320 bp, 符合真菌ITS1 rDNA區(qū)的長度特征, 這表明這兩種鯊魚鰓部都棲息有較豐富的真菌。實(shí)驗(yàn)中也曾使用通用引物對(duì)ITS1、ITS4試圖擴(kuò)增出ITS1-5.8S-ITS2全長序列, 但發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶亮度較為微弱, 不宜用于下一步的變性梯度凝膠電泳, 故未采用。

圖1 兩種鯊魚鰓部真菌ITS1 rDNA及鄰接區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果(A.尖吻鯖鯊; B.噬人鯊)

2.2 變性梯度凝膠電泳DGGE

將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物(ITS1全長序列及相鄰的上游18S和下游5.8S的部分序列)經(jīng)變性梯度凝膠電泳后, 可用于分析兩種鯊魚鰓中的真菌菌群。如圖2結(jié)果顯示, 兩種鯊魚鰓都顯示了較豐富的DGGE指紋, 樣品A、B各含有4條較亮帶, 這表明它們各自含有至少四種優(yōu)勢(shì)菌, 其中帶1為兩樣品的共有條帶, 除此之外, 兩樣品中還都顯示了較豐富的微量條帶, 該結(jié)果表明這兩種鯊魚鰓部均棲息有較豐富的真菌類群。而這兩種鯊魚鰓中的優(yōu)勢(shì)均又存在明顯差異, 這可能與其生活環(huán)境有關(guān), 也可能是由種間差異或個(gè)體差異造成的。

圖2 兩種鯊魚鰓部真菌菌群的DGGE指紋圖譜(左: 紫外成像; 右: 自然光成像。A.尖吻鯖鯊; B.噬人鯊)

為提高擴(kuò)增反應(yīng)的可靠性、提高測(cè)序成功率, 利用引物對(duì)ITS1、ITS2對(duì)上述優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行了第二次PCR擴(kuò)增, 如圖3所示, 7條帶均獲得了較濃的擴(kuò)增產(chǎn)物, 其序列長度符合真菌ITS1區(qū)特征。經(jīng)電泳純化、連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后, 從每個(gè)條帶獲得的3個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序, 結(jié)果一致, 并將序列提交GenBank (表2), 通過BLAST與GenBank收錄的真菌相應(yīng)序列數(shù)據(jù)比對(duì)后, 發(fā)現(xiàn)帶1為青霉屬(), 帶2、3為梗孢酵母屬(), 帶4為枝頂孢屬(), 帶5、6、7為曲霉屬(), 它們與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)種屬菌株序列的相似性達(dá)到了99%—100%。

圖3 經(jīng)第二次PCR擴(kuò)增后的優(yōu)勢(shì)條帶電泳圖

由于BLAST結(jié)果顯示每個(gè)條帶與GenBank收錄的相應(yīng)屬中多個(gè)種的序列相似性數(shù)值均相同, 為進(jìn)一步了解優(yōu)勢(shì)條帶所代表真菌的分類地位, 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載了相應(yīng)屬中多個(gè)種的該段DNA序列進(jìn)行比較, 這些序列均來自一些主要菌種庫, 如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局菌種保藏中心(ARS/NRRL)、荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)、英國真菌保藏中心(CABI)及丹麥科技大學(xué)真菌保藏中心(IBT)的保藏菌株。利用MEGA4.0軟件將其與本實(shí)驗(yàn)中條帶序列一起構(gòu)建了系統(tǒng)樹(NJ法、UPGMA法)。結(jié)果顯示(NJ樹見圖4), 條帶1中的DNA序列與產(chǎn)黃青霉()、灰黃青霉()及袋鼠鼠青霉()的DNA序列具有較近親緣關(guān)系, 條帶5、6、7的DNA序列與聚多曲霉()和肉色曲霉()的DNA序列具有較近親緣關(guān)系, 條帶4的DNA序列與基利枝頂孢霉()的DNA序列具有較近親緣關(guān)系, 條帶2、3的DNA序列與嗜鹽梗孢酵母()的DNA序列關(guān)系較近。UPGMA樹也顯示相同親緣關(guān)系(未附圖)。

表2 DGGE優(yōu)勢(shì)條帶序列BLAST比對(duì)結(jié)果

Tab.2 Sequences’ BLAST result of dominant DGGE bands

3 討論

眾所周知, 鯊魚被發(fā)現(xiàn)患惡性腫瘤的幾率非常低, 約為百萬分之一, 其同類之間因爭(zhēng)奪食物經(jīng)常撕咬造成的外傷能很快愈合, 很少因此導(dǎo)致嚴(yán)重微生物感染, 這種海洋生物可能具有強(qiáng)大的化學(xué)防御機(jī)制(Lee, 1983; 賀麗虹等, 2005; Luer, 2012)。目前國內(nèi)外對(duì)于鯊魚化學(xué)防御及藥用研究主要集中在鯊魚自身成分如角鯊烯、鯊魚肝及胃中的具有抗腫瘤和廣譜抗菌活性的角鯊胺Squalamine以及鯊魚軟骨抗腫瘤成分的研究與開發(fā)(Moore, 1993; Cho, 2002; 賀麗虹等, 2005)。

鯊魚是否存在其他化學(xué)防御機(jī)制, 如共附生微生物的協(xié)助防御呢？這是一個(gè)值得研究的問題。盡管迄今對(duì)于鯊魚共附生微生物研究報(bào)道還比較少, 但已有研究表明共附生微生物是有可能參與鯊魚的化學(xué)防御的。如鄭忠輝等(1998)曾報(bào)道從鯊魚的腸道中分離的一株弧菌和一株未鑒定菌株具有抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鰻弧菌的活性; 另外王燦等(2009)報(bào)道23株分離自姥鯊消化道的細(xì)菌中有65%具有抗菌活性; Luer(2012)報(bào)道從鯊魚的近親——兩種魟魚的體表粘液中分離到的共生細(xì)菌中分別有12.0%或21.6%的菌株可拮抗與外傷感染相關(guān)的病原菌。上述王燦等的報(bào)道中曾提及從姥鯊鰓中分離到5株分類地位及生物活性不詳?shù)奈⑸? 但總而言之, 鯊魚鰓作為一個(gè)新穎的海洋共附生藥源微生物來源, 迄今國內(nèi)外有關(guān)研究報(bào)道仍非常少。

本文研究表明, 在作者采樣的兩個(gè)鯊魚樣本鰓部的確生活有組成較豐富的真菌菌群, 且兩者的優(yōu)勢(shì)菌群存在明顯差異, 其中青霉屬是它們共同的優(yōu)勢(shì)菌, 曲霉屬為尖吻鯖鯊鰓部獨(dú)有優(yōu)勢(shì)菌, 枝頂孢屬和梗孢酵母屬則為噬人鯊鰓部獨(dú)有優(yōu)勢(shì)菌。其中青霉屬、曲霉屬、枝頂孢屬隸屬于子囊菌亞門, 而梗孢酵母屬隸屬于擔(dān)子菌亞門。值得注意的是青霉屬、曲霉屬也是被報(bào)道最多的海洋真菌類群, 這被認(rèn)為跟它們對(duì)于鹽度的較強(qiáng)適應(yīng)能力有關(guān)(Bugni, 2004)。另外, 曲霉、青霉也是最重要的生物活性次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌, 檢索天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫Dictionary of Natural products on DVD (Buckingham, 2011)顯示庫中源自海洋青霉的天然產(chǎn)物多達(dá)235個(gè)(所有已收錄青霉天然產(chǎn)物達(dá)1435個(gè)), 而源自海洋曲霉的多達(dá)244個(gè)(所有已收錄曲霉天然產(chǎn)物達(dá)1524個(gè))。枝頂孢屬也是重要的天然產(chǎn)物來源, 來自整個(gè)自然界的枝頂孢屬天然產(chǎn)物已達(dá)200個(gè), 而源自海洋枝頂孢屬的已達(dá)47個(gè)。梗孢酵母屬最早是從海洋中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)屬(Fell, 1966), 但尚未見到有來自梗孢酵母屬的天然產(chǎn)物收錄。除上文所述優(yōu)勢(shì)菌外, DGGE指紋圖譜顯示這兩種鯊魚鰓中還含有豐富的微量真菌類群, 對(duì)這些微量條帶區(qū)域的進(jìn)一步PCR-DGGE分析有助于更多地了解鯊魚鰓中真菌菌群組成, 而這些分類學(xué)背景將有可能用于指導(dǎo)選擇性培養(yǎng)策略來富集培養(yǎng)盡可能多的可培養(yǎng)真菌, 或運(yùn)用非培養(yǎng)依賴性的宏基因組技術(shù)來有針對(duì)性的克隆一些具有藥用潛力物種的藥源基因。

圖4 基于優(yōu)勢(shì)真菌菌群ITS1及相鄰序列構(gòu)建的NJ聚類分析樹(自展1000次驗(yàn)證節(jié)點(diǎn)置信度)

鯊魚屬于較特殊實(shí)驗(yàn)材料, 從活體鯊魚鰓部現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)取樣具有一定危險(xiǎn)性, 而死亡鯊魚不排除受到空氣中真菌的污染。不過, 由于鯊魚鰓裂外皮對(duì)鰓耙具有一定封閉作用, 且本文鰓樣品采自死亡時(shí)間不足一天且剛運(yùn)抵港口的新鮮鯊魚, 樣品經(jīng)過無菌水重復(fù)沖洗, 可能存在的附著不牢的少量陸源污染真菌被較大程度上排除, 經(jīng)鑒定的DNA條帶確屬報(bào)道較多的海洋真菌類群, 且與GenBank中一些海洋來源菌株序列的相似性達(dá)到了99%—100%。此外, 大量獲取新鮮鯊魚樣本也具有一定困難, 限于實(shí)驗(yàn)條件, 本文所采鯊魚樣本數(shù)量有限, 尚不足以說明這兩條不同種鯊魚鰓部真菌菌群的差異是來自于種間差別抑或個(gè)體差別。對(duì)于以上不足之處, 如條件具備, 仍以從大量活體鯊魚樣本現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)取樣更為科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。另外, 噬人鯊和尖吻鯖鯊均廣布于熱帶、亞熱帶和溫帶海洋, 活動(dòng)范圍廣、行蹤難溯, 關(guān)于其鰓部真菌菌群的差異與其生活環(huán)境的關(guān)系尚難做出推論。

PCR-DGGE作為一種可不依賴于菌株分離培養(yǎng)的技術(shù), 對(duì)于海洋生物宿主中共附生微生物菌群組成的研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然, 該技術(shù)也存在一定局限性, 如Vallaeys等(1997)報(bào)道過DGGE實(shí)驗(yàn)中具有不同序列DNA片段的共遷移現(xiàn)象, 因此為了得到可靠結(jié)果, 本文中對(duì)于DGGE條帶采用克隆測(cè)序是確有必要的。另外動(dòng)物宿主組織DNA樣品成分較為復(fù)雜, 干擾因素多, 這可能也導(dǎo)致了本文中共附生真菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA長序列擴(kuò)增產(chǎn)物濃度過稀, 不足以進(jìn)行DGGE及切膠分離, 從而未能獲得更長序列信息, 以進(jìn)一步鑒定同一屬中的不同種。該技術(shù)有必要與其他分子生物學(xué)、微生物學(xué)方法配合使用, 以提供共附生微生物菌群組成更豐富的信息。

綜上所述, 對(duì)具有藥用潛力的鯊魚鰓部共附生真菌進(jìn)行深入研究, 將有望發(fā)現(xiàn)新穎的活性化合物, 用于治療人類惡性腫瘤、病原微生物感染的新藥的開發(fā), 另外也有助于進(jìn)一步揭示鯊魚的化學(xué)防御機(jī)制, 對(duì)環(huán)境友好的海水養(yǎng)殖抗菌、抗寄生蟲病害藥物的開發(fā)也有借鑒啟示作用。

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THE PCR-DGGE ANALYSIS OF FUNGAL COMMUNITY IN THE GILLS OF TWO SHARK SPECIES

ZHANG Yi1, 2, MU Jun1, 3, FENG Yan1, YAN Song1

(1. School of Environmental and Chemical Engineering, Dalian Jiaotong University, Dalian 116028, China; 2. School of Life Science and Biotechnology, Daian University of Technology, Dalian 116024, China; 3. Marine Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Gill tissue DNA samples were extracted from two shark specimens from East China Sea,and, and used as templates for PCR amplification for the sequences of internal transcribed spacer 1 in ribosomal DNA gene of the fungal communities in the gill tissue. The PCR products were subsequently separated by DGGE (denatured gradient gel electrophoresis). Then, seven main electrophoresis stripes in the spectrum were amplified by secondary PCR, cloned, and sequenced. NCBI-BLAST comparison and molecular phylogenetic analysis indicated that the dominant fungal species in the gills ofcome from four taxonomical units including one from genusand three from. For, one dominant taxonomical unit comes from, two fromand one from A.is the common dominant fungal group in gills of the two shark species. In addition, the DGGE fingerprint also shows the presence of diverse minor fungal groups. Database searching suggested that most of these fungal taxonomical units have good potential in the production of natural bioactive substances. The PCR-DGGE analysis revealed that rich fungal community inhabits the two shark specimens’ gills. More investigations are demanded for understanding the metabolites and interaction with their hosts.

sharks; gills; fungal community; internal transcribed spacer ribosomal DNA; denatured gradient gel electrophoresis

10.11693/hyhz20121205002

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 20902009號(hào); 中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目, 2011M500051號(hào), 2012T50258號(hào); 遼寧省教育廳優(yōu)秀人才支持計(jì)劃, 2009R08號(hào)。張翼, 博士, 副教授, E-mail: hubeizhangyi@163.com

穆軍, 博士, 教授, E-mail: mujun1971@126.com

2012-12-05,

2013-04-22

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