青蛤(Cyclina sinensis)組織蛋白酶L基因的表達(dá)與重組蛋白活性分析*

劉詩(shī)萌 趙 婷 張 皞 潘寶平

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青蛤()組織蛋白酶L基因的表達(dá)與重組蛋白活性分析*

劉詩(shī)萌 趙 婷 張 皞 潘寶平①

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300387)

利用熒光定量PCR方法檢測(cè)了青蛤()在鰻弧菌()脅迫下組織蛋白酶L基因(CsCPL)在各組織的表達(dá)差別及其在血淋巴中的時(shí)序表達(dá)關(guān)系。結(jié)果表明, CsCPL基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、鰓和閉殼肌等組織中普遍表達(dá), 其中以血淋巴表達(dá)水平最高。在鰻弧菌刺激后3—96h青蛤的血淋巴中CsCPL的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯上調(diào), 其中6h達(dá)到最大值并且與對(duì)照組有極其顯著性差異(<0.01), 說明該基因在青蛤免疫反應(yīng)中具有重要作用。文章還對(duì)CsCPL基因進(jìn)行了原核表達(dá), 其產(chǎn)物蛋白分子量約35kDa, 經(jīng)純化及復(fù)性后具有明顯的抑菌作用。

青蛤; 組織蛋白酶L; 實(shí)時(shí)定量PCR; 抑菌實(shí)驗(yàn)

青蛤()是我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(顧潤(rùn)潤(rùn)等, 2006)。近年來隨著國(guó)內(nèi)青蛤增養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加, 加之養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化, 青蛤由病原微生物引起的疾病時(shí)有發(fā)生(孫國(guó)銘等, 2004; 曹華, 2004), 對(duì)該項(xiàng)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)威脅很大。因此, 對(duì)該物種的免疫抗病機(jī)制研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。

貝類的免疫反應(yīng)系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫, 其血細(xì)胞作為抵御外來微生物侵襲的主要承擔(dān)者, 其免疫應(yīng)答功能主要通過血細(xì)胞內(nèi)溶酶體中的多種水解酶進(jìn)行(張朝霞等, 2006)。組織蛋白酶類是重要的溶酶體型半胱氨酸蛋白酶, 即通常所稱的溶酶體型蛋白水解酶類(Kirschke, 1987), 在各種類群生物體中均有發(fā)現(xiàn)(Lecaille, 2002), 且種類眾多, 從組織蛋白酶A到Z都有報(bào)道(Chwieralski, 2006)。根據(jù)催化作用機(jī)制, 大部分的組織蛋白酶歸屬于蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白酶, 有少數(shù)的組織蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶(楊東輝等, 2012)。

組織蛋白酶L是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成員, 以酶原的形式貯存于溶酶體中, 廣泛存在于各種動(dòng)植物、微生物有機(jī)體中(Zeng, 2005; Liu, 2006), 在很多種類的蛋白質(zhì)水解過程中起著非常重要的作用。研究表明組織蛋白酶L還參與許多重要的生理、生命活動(dòng), 如抗原呈遞、組織再生、骨質(zhì)吸收、腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移、炎癥發(fā)生和細(xì)胞凋亡等, 成為近年來備受關(guān)注的一類靶標(biāo)蛋白酶?，F(xiàn)已有研究人員從多種魚體中分離得到組織蛋白酶L, 對(duì)其性質(zhì)研究也比較詳細(xì)(Yamashita, 1990; Lee, 1993; Aranishi, 1997; Visessanguan, 2003)。根據(jù)已見水產(chǎn)動(dòng)物的組織蛋白酶L基因相關(guān)報(bào)道, 組織蛋白酶L在眾多水產(chǎn)動(dòng)物免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用, 如凡納濱對(duì)蝦() (Zhao, 2007)、中國(guó)對(duì)蝦()(Bu, 2008)、中華絨螯蟹()(Li, 2010)、脊尾白蝦()(段亞飛等, 2013)、紫貽貝()(Venier, 2006)、合浦珠母貝()(Ma, 2010)、三角帆蚌()(白志毅等, 2011)、海灣扇貝()(李娟等, 2011)。目前尚未見到青蛤該基因的研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤()樣品采于天津大港灘涂, 暫養(yǎng)于通氣海水中, 海水密度1.02—1.04g/cm3, 水溫21—24°C, 投喂5‰小球藻, 選擇沒有損傷, 形態(tài)上無顯著差異的個(gè)體[平均殼寬(19.12±0.57)mm, 平均殼長(zhǎng)(29.14±1.23)mm, 平均殼高(29.52±1.47)mm], 一周后開始實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)驗(yàn)室保存的鰻弧菌()菌種用2216E培養(yǎng)基于28°C下培養(yǎng)24h, 用無菌海水重懸菌液, 將其濃度調(diào)為OD600= 0.4。采用隨機(jī)分組方法, 每次試驗(yàn)均設(shè)10個(gè)平行組。實(shí)驗(yàn)組青蛤注射50mL/只的鰻弧菌菌液, 對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水。注射前提取血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓, 準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量50mg; 注射后3h、6h、9h、12h、24h、48h、96h時(shí)提取血淋巴。以上組織迅速放入液氮冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 利用TRIZOL法, 提取青蛤各個(gè)組織的總RNA, 采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits方法進(jìn)行分離純化。根據(jù)Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit試劑盒說明書進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建, 采用pBluescript II SK*改造體作為連接載體, 感受態(tài)細(xì)胞為(DH5a)。文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序引物T7-F: 5′ TA-AT-ACGACTCACTATAGG 3′, T3-R: 5′ AATTAAC-CC-TC-ACTAAAGG 3′, 將所得序列去除載體序列后拼接得到contig及無法與其它序列拼接的singlest數(shù)據(jù), 將測(cè)得的序列用BLAST進(jìn)行同源性分析。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 將獲得的青蛤mytimacin基因類似序列的全長(zhǎng)cDNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)作BLASTX分析, 利用開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)在線分析其蛋白質(zhì)序列, 使用SignalP 3.0和SMART分別分析該基因的信號(hào)肽序列并查找結(jié)構(gòu)域, ProtParam工具在線預(yù)測(cè)序列的分子式、分子量和等電點(diǎn), 通過CLUSTALw進(jìn)行氨基酸序列同源性分析。

1.2.3 CsCPL基因在青蛤各組織內(nèi)的表達(dá) 利用TRIZOL法提取血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓的總RNA, 反轉(zhuǎn)成cDNA在-20°C保存?zhèn)溆?。以b- actin基因?yàn)閮?nèi)參基因, 實(shí)時(shí)定量引物分別為b-actin-F: 5′ CACCACAACTGCCGAGAG 3′,b-actin-R: 5′ CCG-A-T-AGTGATGACCTGACC 3′; CPL-F: 5′ GTCACA-TT-CGCCAAGCAA 3′, CPL-R: 5′ TGAAGGACCAGCA-AGAGCC 3′; 反應(yīng)在Rotor-Gene 6000實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行, 擴(kuò)增體系為20mL, 反應(yīng)程序?yàn)? 95°C預(yù)變性30s, 94°C變性5s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s, 40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 CsCPL基因在血淋巴內(nèi)的時(shí)序性表達(dá) 利用TRIZOL法提取鰻弧菌侵染后各時(shí)間點(diǎn)血淋巴總RNA, 并反轉(zhuǎn)成cDNA。熒光定量PCR引物、反應(yīng)體系及程序等見1.2.3。數(shù)據(jù)處理采用2-DDCt法(Livak, 2001), 使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.5青蛤CsCPL的原核表達(dá) 用特異性引物CPL-N: 5′ CATATGCACCATCATCATCATCATTTG-C-C-T-GAGGAAATGGACTGGAGGA 3′; CPL-E: 5′ GAA-TTCTTAAACAAGTGGG TATGATGCCTGG 3′, 擴(kuò)增得到的CsCPL成熟肽基因, 連接到pMD18-T載體, 得到pMD18-T-CPL并用pMD18-T載體通用引物和CsCPL特異性引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選, 測(cè)序鑒定。用RⅠ和Ⅰ雙酶切pMD18-T-CPL, 回收CsCPL基因并與RⅠ和Ⅰ酶切開環(huán)的pET30a(+)連接, 轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中, 得到重組質(zhì)粒pET30a(+)-CPL并用T7引物和CsCPL特異性引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選及測(cè)序鑒定。

1.2.6 重組蛋白的純化復(fù)性與功能驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)化菌株接入到LB液體培養(yǎng)基中(含100mg/mL硫酸卡那霉素), 220r/min, 37°C培養(yǎng)至OD600左右, 取樣1mL作為誘導(dǎo)前對(duì)照, 向剩下的菌液中加入IPTG(終濃度1mg/mL)37°C誘導(dǎo)培養(yǎng), 每隔1h取樣1次, 每次取1mL。取500mL誘導(dǎo)的菌液, 4°C, 6000r/min離心收集菌體, 以菌體裂解液重懸并超聲破碎。4°C, 6000r/min再次離心, 將沉淀重懸并過濾膜后得到重組蛋白粗提液。

將得到的重組蛋白粗提液過Ni柱純化, 使用康為世紀(jì)公司的Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白), 將收集到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。采用透析法進(jìn)行復(fù)性, 將純化后的蛋白放在透析袋中, 再把透析袋放置在含有50mmol/L的Tris-HCl和8、6、5、4、2、1、0mol/L尿素緩沖液中(pH 5.5), 復(fù)性后的蛋白凍干, 稱重,-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

將實(shí)驗(yàn)室凍存的藤黃微球菌菌株37°C, 220r/min培養(yǎng)過夜, 6000r/min, 5min離心收集菌體, 用滅菌TBS溶液清洗三次, 用LB培養(yǎng)基重懸。將等濃度的重組蛋白CsCPL、牛血清白蛋白BSA、溶菌酶Lysozyme及滅菌TBS分別與菌體混合, 加入96孔板中培養(yǎng), 編輯程序, 37°C震蕩培養(yǎng), 每0.5h記錄一次OD600數(shù)據(jù), 共計(jì)4.5h。將輸出數(shù)據(jù)于Excel中進(jìn)行分析整理, 繪制菌生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 青蛤CsCPL基因的結(jié)構(gòu)

構(gòu)建的SMART·cDNA文庫(kù)容量為1.12×106cfu/mL, 重組率約為96.4%。經(jīng)隨機(jī)挑取克隆大規(guī)模測(cè)序后, 利用BLASTX在線比對(duì)后分析發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶Cathepsin家族基因類似序列。該序列與縊蟶()Cathepsin家族cathepsin L3基因相似性最高, 一致性達(dá)到68%。將該序列其命名為青蛤CsCPL, 在Gen Bank的注冊(cè)號(hào)為KJ000064。

所獲得的青蛤CsCPL基因的cDNA序列全長(zhǎng)1632bp, 5’UTR為74bp, 3’UTR為508bp, 開放閱讀框長(zhǎng)度為1050bp, 編碼349個(gè)氨基酸(圖1), 理論分子量為38.84kDa, 理論等電點(diǎn)為5.48, 分子式為C1704H2625N465O540S18。氨基酸組成中甘氨酸(Gly)與絲氨酸(Ser)含量最高, 分別占8.9%和8.6%。其N端具有由15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列MRVLVCLVALVACSV,前體酶原的前體肽含有ERF/WNIN模體(motif)和GNFD模體, 可形成1個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。其酶活性催化域含有4個(gè)催化位點(diǎn)(Gln149, Cys155, His294和Asn316), 兩條組織蛋白酶L簽名序列(E58X3RX3F/WX2NX3IX3N77和G90X1NX1FX1D96)。CsCPL的成熟肽定位于131—349, 預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.41, 較前體肽略有下降, 含有7個(gè)半胱氨酸殘基。

2.2 青蛤CsCPL基因在不同組織內(nèi)的表達(dá)

在鰻弧菌侵染青蛤條件下, 以b-actin在各組織中的表達(dá)量為內(nèi)參對(duì)照, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了CsCPL基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓等五個(gè)組織的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示CsCPL基因在青蛤的以上五個(gè)組織中普遍性表達(dá)(圖2), 但表達(dá)量存在明顯差異, 其中血淋巴中表達(dá)含量最高, 顯著高于其它組織(<0.05), 外套膜表達(dá)次之, 肝臟中含量最低, 表明CsCPL基因主要在血淋巴中表達(dá)。

圖1 CsCPL基因全長(zhǎng)cDNA序列的開放閱讀框及結(jié)構(gòu)域分析

方框?yàn)槠鹗济艽a子, * 表示終止密碼子, 下劃線表示CsCPL信號(hào)肽, 箭頭表示前體域切點(diǎn), 陰影部分表示底物結(jié)合位點(diǎn)

圖2 CsCPL基因在青蛤不同組織中的表達(dá)情況

2.3 青蛤CsCPL基因在血淋巴中的時(shí)序性表達(dá)

在鰻弧菌侵染青蛤后, 以b-actin為內(nèi)參基因, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了CsCPL基因在外套膜組織中的表達(dá)時(shí)序變化(圖3)。發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組在感染后3h表達(dá)量顯著升高(<0.05); 并在6h表達(dá)量達(dá)到最大值, 并且與對(duì)照組差異極顯著(<0.01), 約為對(duì)照組的2.7倍左右; 24h后其表達(dá)量有所下降, 但仍顯著高于對(duì)照組(<0.01); 48—96h基因表達(dá)量逐漸降低并恢復(fù)至正常水平。而對(duì)照組除在6h有顯著升高外, 其余時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化。

圖3 青蛤血淋巴CsCPL基因在鰻弧菌刺激不同時(shí)間相對(duì)表達(dá)量的變化

**表示相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平差異極顯著(<0.01); ##表示該時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與同組注射前(0h)相比差異極顯著(<0.01)

2.4 青蛤CsCPL基因的原核表達(dá)

CsCPL成熟肽基因PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物長(zhǎng)度約660bp的DNA片段, 與預(yù)期大小基本一致。PMD18T-CPL和pET-30a雙酶切后, 將目的片段和線性表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè), 切膠回收, 目的片段大小約660bp(圖4), 符合預(yù)期。將CsCPL目的片段連接至pET-30a線性質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后, 進(jìn)行陽(yáng)性單克隆PCR檢測(cè)并送測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果正確, 重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 CsCPL重組序列PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后, SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示: 誘導(dǎo)后的宿主菌蛋白表達(dá)圖譜發(fā)生了變化, 與未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照樣品比較, 該工程菌株誘導(dǎo)后的樣品在約35kDa處產(chǎn)生了1條明顯的特異性電泳帶(圖5), 其分子量和理論計(jì)算值基本吻合。在誘導(dǎo)3h后, 表達(dá)量不再增加, 確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3h。

圖5 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.5 重組蛋白的純化復(fù)性與功能驗(yàn)證

經(jīng)親和層析分離純化后, 將得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果顯示(圖6), 純化后的蛋白電泳條帶單一, 且分子量在35kDa處, 誘導(dǎo)后宿主菌蛋白圖譜中的特異性條帶位置一致, 可確定該純化后的蛋白就是青蛤CsCPL重組蛋白。

圖6 蛋白純化結(jié)果

注: 從左至右M泳道為蛋白Marker, 1泳道為未加IPTG誘導(dǎo)的空白對(duì)照, 2泳道為誘導(dǎo)4h在35kDa處出現(xiàn)目的帶, 3泳道為純化后的蛋白

重組蛋白抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7), 重組蛋白CsCPL組菌生長(zhǎng)曲線與陰性對(duì)照組(BSA)、空白(TBS)對(duì)照組相比趨勢(shì)明顯偏低, 菌群值明顯偏低, 說明與兩對(duì)照組相比, 重組蛋白CsCPL具有明顯的抑菌效果。但與陽(yáng)性對(duì)照組(Lysozyme)相比其作用強(qiáng)度較低一些。

圖7 藤黃微球菌在重組蛋白及不同對(duì)照環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線

3 討論

本研究得到了青蛤組織蛋白酶L基因編碼區(qū)的全長(zhǎng), 經(jīng)序列比對(duì)與分析發(fā)現(xiàn), 該基因序列與許多水生動(dòng)物的同源序列十分相似, 其結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上相當(dāng)保守。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明, 青蛤組織蛋白酶L的分子量約為35kDa, 與理論預(yù)期值基本吻合, 接近于三角帆蚌(白志毅等, 2011)血細(xì)胞組織蛋白酶L(37.7kDa)、海灣扇貝(李娟等, 2011)組織蛋白酶L(41.2kDa)、紅鰭東方鲀(梁靜真等, 2012)組織蛋白酶L(37.9kDa)、脊尾白蝦(段亞飛等, 2013)血細(xì)胞組織蛋白酶L(35.3kDa)等近緣物種中的分子量。通過對(duì)其蛋白序列的分析, 發(fā)現(xiàn)其氨基酸組成中, 甘氨酸與絲氨酸的含量最高。絲氨酸在新陳代謝與免疫因子的產(chǎn)生中發(fā)揮著作用, 而甘氨酸可作為水解蛋白的增效劑, 且可在人體中合成絲氨酸。組織蛋白酶(cathepsin)作為一類主要存在于溶酶體的蛋白水解酶, 近年來在無脊椎動(dòng)物先天免疫調(diào)控方面的研究取得了較大進(jìn)展。它與核糖核酸酶、b-葡萄糖醛酸酶、乙?；D(zhuǎn)移酶以及其它的蛋白酶一起參與溶酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的消化及轉(zhuǎn)化過程(Mellman, 1996), 且具有水解多種肌肉相關(guān)蛋白的能力, 并參與非caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程(Chwieralski, 2006)。細(xì)胞凋亡是免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié), 各種免疫細(xì)胞的代謝過程大多通過細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)(Krammer, 2000)。因此推測(cè), 組織蛋白酶L在對(duì)內(nèi)源與外源抗原的免疫反應(yīng)中起著重要作用(S?derh?ll, 1998)。

本研究結(jié)果顯示, CsCPL作為一種免疫相關(guān)蛋白基因, 在青蛤各組織中的表達(dá)差異極其顯著, 基本表現(xiàn)為血淋巴>外套膜>鰓>閉殼肌>肝臟。分析其原因可能與CsCPL基因在生物體內(nèi)的作用有關(guān); 在正常情況下, 約90%的組織蛋白酶以酶原的形式貯存于溶酶體中, 隨時(shí)準(zhǔn)備處理內(nèi)源與外源性的抗原物質(zhì)。鑒于雙殼類動(dòng)物屬開管式血循環(huán), 血淋巴中存在大量的酶源性物質(zhì), 并且作為其非特異性免疫防御的重要組織區(qū)域, 相比其它組織能夠更為迅速地上調(diào)CsCPL基因的表達(dá)水平。另外, 雙殼類在其濾食和呼吸時(shí), 外套膜與鰓首先與海水接觸, 是其非特異性免疫的第一道防線, 具有重要的組織免疫防御作用(劉欣欣等, 2013)。

本研究中還發(fā)現(xiàn), 在鰻弧菌侵染的青蛤血淋巴中的CsCPL基因表達(dá)量在6h達(dá)到最大值, 約為對(duì)照組的2.7倍, 與其它文獻(xiàn)如中華絨螯蟹(Li, 2010)和脊尾白蝦(段亞飛等, 2013)等報(bào)道的結(jié)果非常近似, 說明鰻弧菌侵染對(duì)CsCPL基因具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用。當(dāng)青蛤受到該病原物侵襲時(shí), 其免疫因子的相關(guān)基因啟動(dòng), 機(jī)體合成大量抗菌物質(zhì)。在刺激后的12—24h, CsCPL表達(dá)量下降, 可能意味著機(jī)體處于感染后的恢復(fù)期(Sun, 2010), 類似情況也見于上述文獻(xiàn)中的研究結(jié)果。

本研究采用pET-30a作為表達(dá)載體系統(tǒng), 構(gòu)建了pET30α(+)-CPL重組質(zhì)粒, 通過一個(gè)6×His標(biāo)簽和T7啟動(dòng)子來控制表達(dá)的嚴(yán)謹(jǐn)性。His標(biāo)簽可與金屬螯合層析介質(zhì)特異性吸附, 從而實(shí)現(xiàn)融合蛋白的分離與純化。由于His標(biāo)簽較小, 一般不會(huì)影響目的蛋白的理化特征和生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)獲得的融合蛋白大小在35kDa處左右, 與CsCPL分子量理論值38.84kDa基本吻合。另外, 本研究中的重組蛋白CsCPL組菌生長(zhǎng)曲線與BSA、TBS對(duì)照組相比有明顯的抑菌作用, 但其作用效力不如溶菌酶Lysozyme顯著。推測(cè)原因可能是Lysozyme可溶解細(xì)菌細(xì)胞壁中的黏多糖而使使菌體直接降解, 而組織蛋白酶則通過參與細(xì)胞內(nèi)酶原激活完成間接抗菌作用, 故其對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制不如Lysozyme作用強(qiáng)烈。

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ANALYSIS OF EXPRESSION AND RECOMBINANT PROTEINS ACTIVITIES OF CATHEPSIN L GENE FROM

LIU Shi-Meng, ZHAO Ting, ZHANG Hao, PAN Bao-Ping

(College of Life Sciences, Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)

Measure the expression of Cathepsin L gene (CsCPL) between organizations instimulated byand time-dependent expression in hemolymph with RT-PCR method. The results showed that, CsCPL gene expresses abundantly in hemolymph, liver, mantle, gills and adductor muscle and other tissues in, with the highest expression level in hemolymph. The expression of CsCPL in hemolymph appeared a large number of increasement in 3—96 hours afterstimulation, and at 6 hours reach to maximum which was very significant different (<0.01) with the control group, indicating that CsCPL gene plays an important role in the immune response in. Experiments also carried on the CsCPL genetic prokaryotic expression, and got recombinant protein about 35 kDa molecular weight, which has an obvious bacteriostatic action after purification and renaturation.

; cathepsin L; Realtime PCR; bacteriostatic test

10.11693/hyhz20140100009

* 天津市科委應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目資助, 12JCZDJC22800號(hào), 09JCZDJC19300號(hào); 劉詩(shī)萌, E-mail: 934402617@qq.com

潘寶平, 博士, 教授, E-mail: p.baoping@gmail.com

2012-04-25,

2012-07-19

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