海水甲殼類寄生性病原血卵渦鞭蟲(Hematodinium spp.)研究進(jìn)展*

李才文 許文軍

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海水甲殼類寄生性病原血卵渦鞭蟲(spp.)研究進(jìn)展*

李才文1①許文軍2

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 舟山 316100)

血卵渦鞭蟲(spp.)是一類危害海水甲殼類的致病性寄生性甲藻, 在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅了多種重要經(jīng)濟(jì)甲殼類的漁業(yè)生產(chǎn)。近年來, 血卵渦鞭蟲先后在我國浙江、廣東沿海的鋸緣青蟹、三疣梭子蟹、脊尾白對蝦等重要養(yǎng)殖甲殼類中被報(bào)道發(fā)現(xiàn), 并已確定該寄生病原是近年來引起當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖青蟹“黃水病”、三疣梭子蟹“牛奶病”和脊尾白對蝦大規(guī)模死亡的主要病原之一。本文結(jié)合作者近年來關(guān)于spp.的研究成果, 系統(tǒng)綜述了國內(nèi)外該寄生性病原的研究進(jìn)展, 包括其系統(tǒng)分類、生活史、傳播途徑、發(fā)生機(jī)制等; 并針對目前該寄生性病原研究中存在的關(guān)鍵問題, 結(jié)合我國相關(guān)研究現(xiàn)狀做出了分析和展望, 以期為我國海水甲殼類血卵渦鞭蟲流行病的預(yù)防與控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

寄生性甲藻; 生活史; 傳播途徑; 孢子; 水產(chǎn)養(yǎng)殖

血卵渦鞭蟲(spp.)是一類危害海水甲殼類的致病性寄生性甲藻(parasitic dinofla-gellate), 它具有間核結(jié)構(gòu)、蜂窩狀表皮、無甲片甲藻孢子和特征分裂方式等甲藻的典型特征 (Chatton, 1931; Ris, 1974)。自1931年Chatton等首次在法國沿岸綠蟹()報(bào)道發(fā)現(xiàn)感染以來, 已經(jīng)在世界范圍內(nèi)20多種螃蟹、1種對蝦、1種龍蝦和十幾種端足類動物中檢測到和-like spp.感染(表1)。近二十年來,已經(jīng)先后在法國、英國、加拿大、澳大利亞和美國等國家近岸海域大范圍流行(圖1), 并嚴(yán)重威脅到了挪威龍蝦()、美國蘭蟹()、蛛雪蟹()、白氏雪蟹()等多種重要經(jīng)濟(jì)甲殼類的漁業(yè)生產(chǎn)(Field, 1992; Meyers1987; Messick, 2000; Stentiford, 2002, 2003, 2005; Sheppard, 2003)。

近年來, 我們先后在浙江舟山、寧波和臺州海域的海捕和養(yǎng)殖三疣梭子蟹()、鋸緣青蟹()等甲殼類體內(nèi)檢測到感染, 并已初步確定該寄生性病原是近年來引起浙江沿海海水養(yǎng)殖三疣梭子蟹大規(guī)模死亡“牛奶病”和青蟹“黃水病”的主要病原之一(許文軍等, 2007a, b)。2008年Li等在我國廣東汕頭低鹽養(yǎng)殖的鋸緣青蟹中也發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了的發(fā)生。最近, 我們在養(yǎng)殖脊尾白對蝦 ()中也發(fā)現(xiàn)了感染, 并確認(rèn)其是導(dǎo)致當(dāng)?shù)丶刮舶讓ξr規(guī)模性死亡的主要病原, 這是迄今為止首例在對蝦類中確認(rèn)報(bào)道的感染 (Xu, 2010)。的發(fā)生, 不僅給我國蝦蟹類養(yǎng)殖業(yè)造成了直接的經(jīng)濟(jì)損失; 而且由于缺乏有效的控制方法, 許多養(yǎng)殖戶往往在疾病發(fā)生時(shí)大量使用抗生素和殺蟲劑等, 在危害養(yǎng)殖產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí), 也造成了周邊海水環(huán)境的污染。目前國內(nèi)有關(guān)該寄生性甲藻的相關(guān)研究集中于實(shí)地調(diào)查、病原確定、診斷技術(shù)等前期研究, 尚缺乏有關(guān)該類寄生性甲藻生活史特征及其傳播途徑等方面的基礎(chǔ)研究, 這些基礎(chǔ)研究的缺失已經(jīng)制約了在實(shí)際漁業(yè)生產(chǎn)中的針對性預(yù)防和控制。

圖1 Hematodinium spp.在世界范圍內(nèi)的分布

表1spp.的主要海水甲殼類宿主

Tab.1 Major crustacean species infected by Hematodinium spp.

1 系統(tǒng)分類

的系統(tǒng)分類地位并沒有最終確定, 文獻(xiàn)中報(bào)道的和-like spp.組成屬暫列在甲藻(Dinophyceae)綱、寄生藻目(Syndiniales)、寄生藻(Syndiniaceae)科下(Integrated Taxonomic Information System; NCBI Taxonomy Data Base; Stentiford, 2005)。目前該屬僅有兩個(gè)正式命名的物種, 典型種和。典型種最早在法國諾曼底和地中海沿岸的兩種梭子蟹和中被報(bào)道發(fā)現(xiàn)(Chatton, 1931); 后來在附近海域的黃道蟹()和英吉利海峽的天鵝絨梭子蟹()中也報(bào)道了的流行(Latrouite, 1988; Wilhelm, 1996; Stentiford, 2002, 2003)。另外一種發(fā)現(xiàn)于澳大利亞的深海梭子蟹中, 但這種不僅形態(tài)和大小上都與有差異 (Hudson, 1994), 而且18S rRNA的分子測序也存在差異(Hudson, 1996)。而在我國發(fā)現(xiàn)的sp.及其它和-like spp.都沒有正式命名。另外, 在挪威龍蝦、蛛雪蟹和白氏雪蟹中發(fā)現(xiàn)的被認(rèn)為是不同的種(Meyers, 1987; Field, 1992)。在早期文獻(xiàn)中, 研究者認(rèn)為在美國蘭蟹()中發(fā)現(xiàn)的與典型種屬于同一種因而一直沿用這一命名; 然而最新研究表明這種與典型種是不同的基因型(Small, 2012)。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用和生活史研究的進(jìn)一步深入, 我們對于的系統(tǒng)分類將會有更清晰的認(rèn)識。

2 生活史

的生活史比較復(fù)雜, 通常至少包括多核原生質(zhì)期(multinucleate plasmodial stage)、滋養(yǎng)體(trophont)和孢子(dinospore)三個(gè)階段 (Shields, 1994; Stentiford, 2005)。有關(guān)生活史研究的報(bào)道較少, 目前只有從挪威龍蝦和美國蘭蟹中分離出來的種已經(jīng)有了較為完整的生活史研究(Appleton, 1998; Li, 2011a), 除此之外, 包括典型種在內(nèi)的其它30多種都沒有生活史方面的系統(tǒng)研究, 這也從客觀上限制了該類寄生蟲在系統(tǒng)分類和傳播途徑方面的研究。Appleton等(1998)從挪威龍蝦中分離出并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大孢子(macrospore)或小孢子(microspore)先發(fā)展成為絲狀滋養(yǎng)體(filamentous trophont), 而后進(jìn)一步形成絲狀滋養(yǎng)體集合體(Gorgonlocks trophonts colony)。這些絲狀滋養(yǎng)體集合體既能發(fā)展成為團(tuán)塊狀聚合體(clump colony), 而后形成更多的絲狀滋養(yǎng)體; 又會發(fā)育成為蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體(arachnoid trophonts), 并發(fā)展成為蛛網(wǎng)狀孢子體(arachnoid sporonts)。蛛網(wǎng)狀孢子體通過孢子生殖產(chǎn)生大量孢子母細(xì)胞(sporoblasts), 進(jìn)一步發(fā)展成為大孢子或小孢子。

最近, 美國蘭蟹中的生活史研究也取得了突破性進(jìn)展, Li等(2011a)首次實(shí)現(xiàn)了ex的體外連續(xù)培養(yǎng), 并闡明了其完整生活史。與挪威龍蝦的生活史類似, 蘭蟹中的生活史經(jīng)歷了絲狀滋養(yǎng)體(圖2a)、類變形蟲滋養(yǎng)體(amoeboid trophont)(圖2b)、蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體(圖2c)、蛛網(wǎng)狀孢子體(圖2d)、孢子母細(xì)胞、孢子前細(xì)胞(prespore)(圖2e)和孢子(圖2f)等階段。然而, 蘭蟹中的生活史發(fā)展過程與挪威龍蝦的生活史又存在明顯差異(Appleton, 1998; Li, 2011a)。首先絲狀滋養(yǎng)體集合體(Gorgonlocks trophonts colony)并不是由絲狀滋養(yǎng)體發(fā)展而成, 而是從裂殖體(schizont)中發(fā)展出來, 而后形成為絲狀滋養(yǎng)體, 并進(jìn)一步發(fā)展成團(tuán)塊狀聚合體。裂殖體(schizont)這個(gè)發(fā)展階段是首次在生活史中報(bào)道發(fā)現(xiàn)。裂殖體一般出現(xiàn)在蛛網(wǎng)狀孢子體的發(fā)展末期, 包埋在孢子母細(xì)胞中。網(wǎng)狀孢子體是蘭蟹中的生活史發(fā)展的重要階段, 它既可以延續(xù)在宿主體內(nèi)的繼續(xù)增殖, 又承啟在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染。但是究竟是什么因素調(diào)控蛛網(wǎng)狀孢子體生成裂殖體或孢子母細(xì)胞有待進(jìn)一步 研究。

3 傳播、擴(kuò)散方式

在蝦蟹類宿主中的傳播途徑目前尚未清晰, 這很大程度上受限于我們對生活史以及關(guān)鍵生活史階段在傳播過程中的作用缺乏了解。同類相食(cannibalism)、性傳播(sexual trans-mission)和水體傳播(waterborne transmission)是海水病原微生物的常見傳播途徑。Meyers等(1996)在少數(shù)幾個(gè)白氏雪蟹的雄性個(gè)體輸精管液體中發(fā)現(xiàn)了, 認(rèn)為性傳播是的可能傳播途徑之一, 但迄今沒有進(jìn)一步的研究證實(shí)這一假設(shè)。近年來研究者雖然進(jìn)行了一些投喂感染實(shí)驗(yàn), 但對于同類相食是否是主要的傳播途徑尚無一致的結(jié)論。Hudson等(1994c)發(fā)現(xiàn)澳大利亞深海梭子蟹并不能通過攝食染病蟹組織獲得感染。Sheppard等(2003)提到在美國蘭蟹中可以通過投喂染病組織在幼蟹()中傳播, 但并沒有詳細(xì)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。近來, Walker等(2009)研究報(bào)道, 經(jīng)過一次投喂實(shí)驗(yàn), 63%的實(shí)驗(yàn)蘭蟹(共11只)在24小時(shí)內(nèi)檢測出感染, 并且有些已經(jīng)呈重度感染。這些結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的在蘭蟹宿主體內(nèi)的增殖過程有很大差異, 因?yàn)樵谔m蟹注射感染實(shí)驗(yàn)中, 注射高劑量蟲體后7—14天才會發(fā)現(xiàn)中度感染的宿主(Shields, 2000)。

圖2 美國蘭蟹中Hematodinium sp.的典型生活史階段

a. 絲狀滋養(yǎng)體; b. 類變形蟲滋養(yǎng)體; c. 蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體; d.蛛網(wǎng)狀孢子體; e. 孢子母細(xì)胞、孢子前細(xì)胞; f. 孢子. 圖中比例尺為50μm

鑒于同類相食(cannibalism)這種傳播方式的爭議性結(jié)論, 筆者用幼體和成體蘭蟹進(jìn)行了多次投喂感染實(shí)驗(yàn)(Li, 2011b), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在120只實(shí)驗(yàn)蘭蟹中, 只發(fā)現(xiàn)兩只蘭蟹感染, 而且這兩只蘭蟹很可能在實(shí)驗(yàn)前已經(jīng)攜帶, 只是在實(shí)驗(yàn)前的初檢中沒有被檢測出來。在同時(shí)進(jìn)行的注射感染實(shí)驗(yàn)中, 直到注射感染后11—21天才發(fā)現(xiàn)有明顯的感染。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Walker等(2009)有明顯差異, 本文認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中使用了具有隱性感染的蘭蟹可能是導(dǎo)致不同結(jié)論的原因之一。大部分蟹類是很活躍的同類攝食類, 而且成蟹比幼蟹具有更高的捕食率, 因此假如同類相食是傳播的首要途徑,應(yīng)該在成蟹中具有更高的發(fā)病率, 但這種假設(shè)結(jié)果與實(shí)地的流行病調(diào)查結(jié)果不符, 因?yàn)樵谟左w宿主中發(fā)病率更高(Messick, 1994; Field, 1998; Messick, 2000)。而且如果同類相食是傳播的首要途徑, 由于蟹類的同類相食在攝食期間是一直發(fā)生的, 理論上推測在宿主群體的發(fā)病率應(yīng)該相對穩(wěn)定, 而不是觀察到的季節(jié)性發(fā)病(Meyers, 1990; Eaton, 1991; Love, 1993; Messick, 1994, 2000; Field, 1998; Sheppard, 2003)。因此, 同類相食在該類病害傳播過程中的確切作用, 以及在宿主群體間的主要傳播途徑還有待于進(jìn)一步研究。

與典型甲藻類似, 大多數(shù)寄生性甲藻也是通過孢子在水體中擴(kuò)散和個(gè)體間傳播(Anderson, 1982; Cachon, 1987; Coats, 1999)。Appleton等(1998)在進(jìn)行ex.連續(xù)培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)孢子可以直接發(fā)展為絲狀滋養(yǎng)體, 而絲狀滋養(yǎng)體一般出現(xiàn)在感染初期的宿主內(nèi); 筆者在進(jìn)行ex培養(yǎng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的發(fā)生發(fā)展模式(Li, 2011a)。有文獻(xiàn)報(bào)道長期感染的甲殼類宿主在感染晚期會通過腮絲釋放大量的孢子到環(huán)境水體中(Appleton, 1998; Shields, 2000), 宿主在釋放孢子不久后死亡(Love, 1993; Stentiford, 2002)。筆者在研究美國蘭蟹中的時(shí), 也多次發(fā)現(xiàn)重度感染的蘭蟹會釋放大量的孢子, 在暫養(yǎng)池內(nèi)孢子濃度可達(dá)106/mL以上 (Li, 2010), 這些孢子在局部范圍內(nèi)的濃度甚至高于某些典型的有害藻華(Hallegraeff, 1993; Smayda, 1997)。Eaton等(1991)報(bào)道在白氏雪蟹()時(shí)發(fā)現(xiàn)的大小兩種孢子注射到健康蟹體內(nèi)后, 都可以引起新的感染。我們最近還發(fā)現(xiàn)蘭蟹中孢子在適宜鹽度條件下(>20)一般可存活5—7天以上, 而滋養(yǎng)體階段則在24小時(shí)內(nèi)已經(jīng)死亡或喪失活性(Li, 2011b)。由此我們推斷孢子很可能是傳播過程的關(guān)鍵階段; 然而,孢子是真正的傳播階段, 還是一個(gè)中間階段？孢子怎么由環(huán)境水體進(jìn)入新的宿主體內(nèi)并造成感染？這些都有待進(jìn)一步的調(diào)查研究和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 發(fā)病規(guī)律

在易感蝦蟹類宿主群體的發(fā)病具有明顯的季節(jié)性。長期的流行病學(xué)調(diào)查顯示, 在挪威龍蝦中一般在冬春季達(dá)到發(fā)病高峰(發(fā)病率可達(dá)70%), 而在夏秋季則降至低點(diǎn)(發(fā)病率18%—35%)(Field, 1992, 1998; Stentiford, 2001a; Briggs, 2002)。在白氏雪蟹中,一般在夏季達(dá)到發(fā)病高峰, 到冬季則降至低點(diǎn)(Meyers, 1990; Eaton, 1991; Love, 1993)。在美國蘭蟹中,一般在秋季達(dá)到明顯的發(fā)病高峰, 在冬季則幾乎檢測不到發(fā)病; 而后到第二年春天, 發(fā)病率又開始回升 (Messick, 2000; Sheppard, 2003)。在幼體蝦蟹中具有較高的發(fā)病率, 而幼體需經(jīng)過多次連續(xù)蛻皮后才能成長為成體(Tagatz, 1968), 上述幾種蝦蟹類都有季節(jié)性的蛻皮現(xiàn)象。因此很多研究者認(rèn)為在這些宿主內(nèi)的傳播發(fā)生與宿主蛻皮有緊密聯(lián)系(Meyers, 1990; Eaton, 1991; Field, 1992; Love, 1993; Stentiford, 2001a; Shields, 2005)。Meyers等(1990)和Love等(1993)研究發(fā)現(xiàn)重度染病白氏雪蟹一般在夏季釋放孢子, 認(rèn)為疾病傳播也發(fā)生在夏季并達(dá)到發(fā)病高峰。據(jù)此, 不少研究者推測孢子有可能在宿主蛻皮期間侵入宿主體內(nèi)而造成疾病的發(fā)生和大規(guī)模傳播, 但具體機(jī)理尚不清楚(Meyers, 1990; Eaton, 1991; Stentiford, 2001a; Shields, 2005, 2007)。

的流行也受溫度、鹽度等環(huán)境因素的影響。Messick(1999)發(fā)現(xiàn)當(dāng)水溫高于15°C時(shí), 美國蘭蟹的感染較嚴(yán)重, 水溫低于15°C則感染較少。另外筆者在進(jìn)行美國蘭蟹體外培養(yǎng)時(shí), 也發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度低于15°C時(shí),生長發(fā)育比較緩慢, 甚至不能完成生活史(Li, 2011a)。Appleton等(1998)研究發(fā)現(xiàn)挪威龍蝦生長發(fā)育的適宜溫度范圍為8—15°C。除溫度外, 鹽度也是影響傳播的重要因素之一。在生活在鹽度低于18的美國蘭蟹中, 幾乎沒有發(fā)現(xiàn)感染(Newman, 1975; Messick, 1992, 2000)。Coffey等(2012)進(jìn)行了美國蘭蟹在不同鹽度條件下的感染實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)鹽度并不能影響在蘭蟹體內(nèi)的增值, 盡管的孢子在鹽度低于15的水體中會迅速失去活性而死亡(未發(fā)表數(shù)據(jù))。這說明攜帶感染的蘭蟹在低鹽條件下會繼續(xù)發(fā)展感染, 但由于釋放到水體的孢子會迅速死亡, 可能并不會造成的繼續(xù)傳播。

5 定性、定量檢測

有些嚴(yán)重感染的個(gè)體可以通過外部癥狀觀察初步確定, 例如感染的宿主其外觀會體色暗淡或關(guān)節(jié)膜處呈白堊色, 重度感染的挪威龍蝦()會呈現(xiàn)出甲殼高溫加熱變性后特有的紅橙色(Field, 1992; Stentiford, 2000)。此外,感染會導(dǎo)致宿主肌肉口感改變, 如蛛雪蟹()和白氏雪蟹()感染后肉質(zhì)變苦, 在當(dāng)?shù)赜址Q為“苦蟹病” (bitter crab disease, BCD)(Meyers, 1987; Taylor, 1995; Dawe, 2002)。然而, 在美國蘭蟹和我國養(yǎng)殖蝦蟹類中發(fā)現(xiàn)的感染沒有明顯的體表癥狀, 需要借助血涂片法和化學(xué)染色法進(jìn)一步確認(rèn)感染(Messick, 1994; Messick, 2000; 許文軍等, 2007a, 2007b, 2010)。

主要寄生于甲殼類宿主的血淋巴和血腔、肝胰腺、心臟、肌肉等組織器官的血腔內(nèi)。感染晚期的宿主的血細(xì)胞數(shù)量會顯著降低, 代之以大量寄生蟲體; 血淋巴由正常時(shí)的藍(lán)青色、能瞬間凝集的液體轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色或乳白色牛奶狀不能凝固的變性液體。在血淋巴液中可觀察到典型發(fā)育階段的蟲體, 如絲狀變形體(filamentous trophonts or plasmodium)、單核或多核滋養(yǎng)體階段(trophonts)、以及甲藻孢子階段(dinospores)。利用顯微鏡觀察中性紅染色的新鮮血淋巴涂片(wet smears), 可以基本確定是否有該寄生蟲的感染; 除孢子階段外, 血淋巴中常見的絲狀變形體和滋養(yǎng)體細(xì)胞中的溶酶體(lysosomes)均會被中性紅染色, 從而在顯微鏡下顯示特征紅色(Stentiford, 2005)(圖3a, b)。另外, 也可以通過制作干血涂片, 而后用甲醇或Bouins固定劑固定, 再用Giemsa或蘇木精-曙紅(hematoxylin-eosin staining, H&E)染色(圖3c)來定性檢測感染 (Meyers, 1987; Love, 1993; Hudson, 1994c; Messick, 1994; Messick, 2000)。

圖3 Hematodinium spp.的常見病理學(xué)形態(tài)及檢測

a. 中性紅染色的絲狀滋養(yǎng)體; b. 中性紅染色的類變形蟲滋養(yǎng)體; c. H&E染色的感染肝胰腺組織(長箭頭指示絲狀滋養(yǎng)體, 短箭頭指示宿主組織細(xì)胞); d. 間接熒光抗體檢測血淋巴中類變形蟲滋養(yǎng)體(長箭頭指示類變形蟲滋養(yǎng)體, 短箭頭指示血淋巴細(xì)胞). 圖中a 和b 比例尺為10μm, c 和d 比例尺為20μm.

組織病理學(xué)檢測顯示患病宿主的肝胰腺、心臟、肌肉、鰓的組織切片中均會觀察到大量寄生原蟲, 被寄生蟲侵襲的組織出現(xiàn)以壞死為主的變質(zhì)性病變。肝胰腺細(xì)胞大部分水腫、變性, 可見輕度細(xì)胞排列紊亂, 部分細(xì)胞核壞死消失; 肝管上皮細(xì)胞間界線模糊、消失, 細(xì)胞核固縮或溶解, 乃至整個(gè)肝管細(xì)胞都壞死, 肝管間的血腔隙及結(jié)締組織間充滿大量寄生原蟲。染病宿主鰓絲變性、壞死, 鰓上皮細(xì)胞水腫變性, 鰓腔擴(kuò)張, 鰓腔內(nèi)有大量寄生原蟲。心肌纖維濁腫, 呈現(xiàn)與步足肌相同的肌纖維斷裂溶解現(xiàn)象, 大部分橫紋消失, 心肌纖維彎曲、斷裂和局部壞死, 其間寄生有大量寄生原蟲。足部肌肉纖維斷裂, 橫紋消失, 呈均質(zhì)樣變性或壞死; 肌束間空隙擴(kuò)大并寄生有大量蟲體。感染末期的甲殼動物宿主往往由于寄生蟲在體內(nèi)大量增生而造成宿主感染器官的顯著組織病理變化, 并最終由于呼吸代謝系統(tǒng)功能紊亂乃至喪失而死亡 (Field, 1995; Taylor, 1996; Stentiford, 2005)。

除上述方法外, 分子生物學(xué)技術(shù)如PCR、DNA探針、qRT-PCR等在的定性、定量檢測方面都得到了廣泛應(yīng)用。例如早期的針對屬 (Hudson, 1994a, 1996; Gruebl, 2002; 施慧等, 2008), 以及更為特異的針對ex.種的定性傳統(tǒng)PCR方法和DNA探針檢測(Small, 2007; Li, 2010)都可以比較靈敏的檢測輕度感染; 基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop- mediated isothermal amplification, LAMP)的高靈敏度、快速診斷方法也得到了實(shí)際應(yīng)用(施慧等, 2010); 另外, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantative real-time PCR)技術(shù)也成功地用于定量檢測水體中的孢子(Frischer, 2006; Nagle, 2009; Li, 2010)?；诩?xì)胞多克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附檢測(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和間接熒光抗體檢測技術(shù)(Indirect fluorescent antibody technique, IFAT)(圖3d)等在的檢測方面也得到了一定程度的應(yīng)用(Stentiford, 2001b; Small, 2002; 謝建軍等, 2009; 查智輝等, 2011)。

6 我國Hematodinium研究現(xiàn)狀及展望

孟慶顯和俞開康早在1996年綜述國內(nèi)外海水養(yǎng)殖常見疾病時(shí)曾引述了國外的研究(孟慶顯等, 1996), 并將譯為血卵渦鞭蟲。

2004年7—9月, 許文軍等在對浙江舟山市三疣梭子蟹養(yǎng)殖基地“牛奶病”病蟹取樣調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn), 大部分瀕死的病蟹有相似的典型癥狀, 即蟹體消瘦, 肌肉白濁, 蟹蓋內(nèi)充滿大量乳白色液體。光鏡觀察乳白色液體發(fā)現(xiàn)大量蟲體, 幾乎沒有血淋巴細(xì)胞。高倍顯微鏡和電鏡觀察, 可清楚看到該寄生蟲帶有兩根鞭毛, 大小約7—9μm。從不同病蟹的血淋巴液中發(fā)現(xiàn)了處于其他發(fā)育階段的蟲體, 大多呈卵圓型, 大小約14—16μm。染病梭子蟹的內(nèi)臟及肌肉組織有顯著的組織病理變化, 被侵染的組織出現(xiàn)以壞死為主的變質(zhì)性病變, 在H&E染色的肝胰腺、心臟、肌肉、腮的組織切片中均發(fā)現(xiàn)有大量寄生蟲。該寄生蟲的大小、形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、寄生部位以及宿主組織病理變化, 均與文獻(xiàn)中報(bào)道描述的類似。采用針對的特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn), 陽性樣品均能擴(kuò)增出分子量為580bp左右的特異性條帶, 并且序列一致 (Hudson, 1994a, 1996), 由此確定該寄生蟲為一種sp. (許文軍等, 2007a, b)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 所有“牛奶病”病蟹肝胰臟、心臟、足部肌肉以及鰓等部位均充滿上述寄生蟲, 而作為對照組健康梭子蟹的各器官組織中則未發(fā)現(xiàn), 表明該寄生蟲與梭子蟹的牛奶癥有密切關(guān)系?！芭Ｄ滩　辈⌒钒l(fā)病中后期, 由于寄生蟲的大量寄生, 導(dǎo)致血淋巴數(shù)量急劇下降, 使體液表現(xiàn)出濁白色和不能凝聚等癥狀; 同時(shí)病蟹各重要組織器官均發(fā)生嚴(yán)重病變, 導(dǎo)致主要生理功能喪失, 如鰓組織病變, 導(dǎo)致呼吸功能受阻, 病蟹往往浮游于水面或池邊淺水處, 進(jìn)而死亡; 心肌纖維病變, 導(dǎo)致血淋巴循環(huán)障礙; 肝胰腺病變, 導(dǎo)致新陳代謝紊亂, 病蟹攝食、活動能力減弱, 反應(yīng)遲鈍, 行動緩慢等, 進(jìn)一步導(dǎo)致病蟹死亡。對病蟹的細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示, 多數(shù)病蟹的血淋巴以及肝胰腺未分離到細(xì)菌; 雖然少數(shù)分離到細(xì)菌, 但是種類較雜, 且不同病蟹缺少共性; 我們認(rèn)為細(xì)菌是在梭子蟹體質(zhì)下降, 感染卵渦鞭蟲的同時(shí)或之后獲得的繼發(fā)感染, 雖然其可能促進(jìn)病蟹的死亡, 但并非此次梭子蟹“牛奶病”的主要病原。另外, 電鏡結(jié)果顯示, 病蟹的肝胰腺、心肌、血淋巴以及鰓絲等組織均未發(fā)現(xiàn)有病毒顆粒, 而血卵渦鞭蟲則在所有的組織中大量存在。綜合調(diào)查研究結(jié)果, 我們確定血卵渦鞭蟲(sp.)是導(dǎo)致這次養(yǎng)殖梭子蟹“牛奶病”暴發(fā)死亡的主要病原。這也是國內(nèi)首次報(bào)道的蟹類sp.感染并在養(yǎng)殖中引起暴發(fā)性死亡。隨后我們陸續(xù)在附近海區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)的鋸緣青蟹和脊尾白對蝦中發(fā)現(xiàn)了sp.感染, 并已確定該寄生蟲是浙江沿海海水養(yǎng)殖青蟹“黃水病”和養(yǎng)殖脊尾白對蝦大規(guī)模死亡的的重要病原之一。后來, Li等(2008)在我國廣東汕頭的養(yǎng)殖鋸緣青蟹中也報(bào)道發(fā)現(xiàn)了感染, 這是迄今第一次在低鹽環(huán)境(<9)中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的感染。

在我國發(fā)現(xiàn)的常見生活史形態(tài)已確定包括滋養(yǎng)體(單核或多核)和孢子階段; 然而, 由于目前還沒有實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)連續(xù)培養(yǎng), 該種的完整生活史目前尚不清楚。初步基因片斷(SSU rDNA 和 ITS1)序列分析結(jié)果表明, 感染我國舟山群島附近海域三疣梭子蟹、鋸緣青蟹和脊尾白對蝦的sp.是同一種; 而且與美國蘭蟹中發(fā)現(xiàn)的sp.具有較近的分子種系演化關(guān)系。因此, 我們可以借鑒美國蘭蟹中sp.的研究進(jìn)展, 對我國發(fā)現(xiàn)的這種sp.的完整生活史和傳播方式進(jìn)行系統(tǒng)研究; 并通過與典型種和其他sp.的生活史和分子種系演化關(guān)系進(jìn)行比較研究, 以期對我國發(fā)現(xiàn)的sp.正式命名并確定其系統(tǒng)分類地位。另外, 該病在圍塘老化、水交換差的池塘容易發(fā)生; 在7—9月高水溫期以及在溫度鹽度環(huán)境變化較大的梅雨季節(jié)和臺風(fēng)季節(jié)也容易發(fā)病。但具體哪些環(huán)境因子與其在該區(qū)域的傳播流行相關(guān), 以及相關(guān)環(huán)境因子的具體作用機(jī)制都有待進(jìn)一步的調(diào)查研究。我國集約工廠化養(yǎng)殖是蝦蟹類的主要產(chǎn)業(yè)模式, 流行性疾病在這種養(yǎng)殖系統(tǒng)中可能更易于傳播擴(kuò)散。因此我們更迫切需要系統(tǒng)研究在我國發(fā)現(xiàn)的的生活史和傳播、擴(kuò)散途徑, 以期減少直接經(jīng)濟(jì)損失和由于濫用抗生素和殺蟲劑等而造成的環(huán)境污染。

7 結(jié)語

寄生性甲藻(parasitic dinoflagellates)廣泛寄生于甲殼類動物和藻類等體內(nèi)(Cachon, 1987; Shields, 1994; Coats, 1999), 是目前國際上海洋微型生物研究的新熱點(diǎn)之一。甲殼類寄生性甲藻血卵渦鞭蟲(spp.)流行和宿主范圍廣、宿主死亡率高, 給蝦蟹類漁業(yè)生產(chǎn)帶來的危害堪比蝦類白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)病和龍蝦類高夫敗血病(Gaffekemia), 已開始受到國外越來越多研究者的重視(Stentiford, 2005)。而且不僅是海水甲殼類的重要病原微生物, 近來也被有些研究者歸類為非典型性有害藻華物種(Harmful algal bloom, HAB)(Burkholder, 2006; Frischer, 2006)。蝦蟹類養(yǎng)殖是我國沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè), 流行性疾病的暴發(fā)會嚴(yán)重影響到海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為此我們在關(guān)注常見流行性海洋病原微生物的同時(shí), 也應(yīng)該重視諸如寄生性甲藻等這些原來不具備流行條件, 而隨著近海海水環(huán)境的變化而逐漸流行起來的新興海洋病原微生物, 并開展系統(tǒng)的調(diào)查研究。

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REVIEW ON PARASITIC DINOFLAGELLATESSPP. IN MAJOR MARINE CRUSTACEANS

LI Cai-Wen1, XU Wen-Jun2

(1. Key Lab of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Key Lab of Mariculture and Enhancement, Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316100, China)

is a type of parasitic dinoflagellates infecting marine crustacea. It would affect severely various stocks of commercial valuable crustacean fisheries worldwidely. Recently,was found in southeast coast of China and had caused epidemic diseases in several cultured crustaceans, such as,, and, and was identified the causative agent of certain epidemic diseases. However, current research in China focused on field survey, pathogen identification, and diagnostics, little is known about the life cycle and transmission of this dinoflagellate. Understanding its life cycle and transmission is critical to control the spreading of the epidemic pathogen. Thereby, we review the biology and ecology ofspp. in marine crustaceans, focusing on taxonomy, life cycle, transmission, epidemiology etc., to highlight key aspects of the pathogen in the future research and practical strategies to control the spreading of the disease.

parasitic dinoflagellates; life cycle; transmission; dinospores; aquaculture

10.11693/hyhz20120905001

* 國家基金委創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金項(xiàng)目, 41121064號; 國家基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目, 41206145號; 浙江省科技廳院所專項(xiàng)項(xiàng)目, 2011F30017號; 浙江省舟山市科技局項(xiàng)目, 2012C23003號; 海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目, 201005015-1號。

李才文, 研究員, 博士生導(dǎo)師, E-mail: cwli@qdio.ac.cn

2012-09-05,

2012-12-10

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