稀釋液及稀釋倍數(shù)對羊精液低溫保存效果的研究進(jìn)展

慕 勇，胡建宏

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

精液保存技術(shù)自發(fā)明以來，成為提高優(yōu)良種畜利用率、加速育種進(jìn)程最有效的手段之一，為畜牧業(yè)發(fā)展做出巨大貢獻(xiàn)。精液的保存方法分為冷凍保存和液態(tài)保存，冷凍保存以實(shí)現(xiàn)長期保存，擴(kuò)大橫式的地域種質(zhì)交流和縱式的品種資源保存。液態(tài)保存時(shí)間較短，分為常溫保存（15～25 ℃）和低溫液態(tài)保存（0～5 ℃），用以擴(kuò)大精液量，提高種畜利用率。目前，除了在牛精液冷凍保存技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，而其他物種（豬、羊、禽等）的精液冷凍保存效果不盡理想。近年來人們將人工授精的工作重點(diǎn)放在液態(tài)精液的應(yīng)用上，特別是豬、馬、兔、羊等家畜冷凍精液尚難在生產(chǎn)上推廣的現(xiàn)狀下，液態(tài)保存精液有很大的應(yīng)用前景。在精液液態(tài)保存過程中，人們采用諸多方法如降低能量消耗、抑制精子代謝活動(dòng)、保護(hù)精子線粒體等以達(dá)到延長精液保存時(shí)間而保持較好受精能力的目的。山羊精液液態(tài)保存的適宜溫度為2～15 ℃，一般為4～5 ℃最優(yōu)。迄今為止已有很多稀釋液用于山羊精液的液態(tài)保存，如檸檬酸鈉－卵黃，蔗糖－乙二胺四乙酸（EDTA），檸檬酸鈉－果糖－卵黃等。但保存效果都不太理想，保存時(shí)間一般在5～72h。國內(nèi)外關(guān)于液態(tài)保存山羊精液的研究很多，然而稀釋液成分大多比較復(fù)雜、繁多，保存效果也并不十分理想，降低了優(yōu)良種公羊利用率，增加養(yǎng)殖成本。本文針對羊精液低溫保存稀釋液的成分及其作用、精液的稀釋倍數(shù)等進(jìn)行綜述，旨在為山羊精液的低溫保存研究提供一定的參考。

1 精液低溫保存技術(shù)

精液的低溫保存是指將稀釋處理好的精液在0～5 ℃條件下保存。其原理是通過降低溫度，使精子代謝活動(dòng)減弱，當(dāng)溫度降至0～5 ℃時(shí)，精子代謝較弱，幾乎處于休眠狀態(tài)，此時(shí)精子的物質(zhì)代謝和能量代謝水平降到最低，廢物積累減少。而且低溫保存條件還能有效抑制有害微生物的生長，有利于精子生存，從而延長精子的存活時(shí)間。低溫保存的精液，當(dāng)溫度回升后，能恢復(fù)正常代謝機(jī)能而不喪失受精能力。精液在稀釋過程中精液的成分發(fā)生改變會(huì)引起精子理化性質(zhì)的變化，甚至有可能對精子帶來致命打擊，精液溫度降低時(shí)精子也會(huì)因受到冷打擊而造成精子冷休克。因此好的的保存稀釋液是人工授精技術(shù)得以順利實(shí)施的關(guān)鍵。合理的選擇稀釋液成份以及正確的稀釋方法和稀釋倍數(shù)是保障低溫保存效果優(yōu)良的技術(shù)關(guān)鍵。

2 稀釋液的主要成分和生理作用

稀釋液作為精子的生活環(huán)境，其目的是抑制精子代謝活動(dòng)，降低能量消耗，從而延長精子保存時(shí)間而不使其喪失受精能力。在低溫條件下，稀釋液的主要作用就是為精子提供能量，優(yōu)化精子所處環(huán)境的滲透壓及pH，防止精子細(xì)胞內(nèi)磷脂的流失并起到抗冷休克的作用，去除高度稀釋對精子的負(fù)面影響，防止細(xì)菌污染，給精子適應(yīng)外界環(huán)境創(chuàng)造有利條件。因此，良好的稀釋液應(yīng)具備以下功能：提供精子運(yùn)動(dòng)所需能量；抵抗冷休克；緩沖pH 變化；平衡滲透壓和電解質(zhì)；抑菌殺菌；擴(kuò)大精液量。

2.1 糖類

精子的存活和維持運(yùn)動(dòng)需要消耗能量，糖類作為能源物質(zhì)，可為精子提供營養(yǎng)，補(bǔ)充精子能量。大量研究證明，精子不能直接利用外界營養(yǎng)物質(zhì)，而主要靠分解精子細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)來獲取能量。小分子糖類（如葡萄糖、果糖）能穿過精子質(zhì)膜為精子代謝提供能量，而大分子糖類（如蔗糖、海藻糖和葡聚糖）不能穿過精子質(zhì)膜，但能調(diào)節(jié)滲透壓，維持質(zhì)膜穩(wěn)定性，以利于精子的存活［1］。稀釋液中常用葡萄糖和果糖為精子補(bǔ)充能量，趙本田等［2］認(rèn)為山羊精液保存時(shí)以只含葡萄糖時(shí)保存效果最好。徐振軍等［3］對絨山羊精液低溫保存研究中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加蔗糖和乳糖對維持精子活力和保護(hù)精子頂體并沒有顯著效果，認(rèn)為該兩種糖的添加使稀釋液粘稠度增加，降低了精子的活力。Salamon等［4］研究認(rèn)為，在液態(tài)保存中，蔗糖等二糖并不為精子提供能量，只是起到在維持胞外滲透壓、保護(hù)質(zhì)膜的作用。

2.2 緩沖物質(zhì)

正常情況下，山羊精液呈弱酸性或中性，pH 為6.8～7.0 之間。為防止稀釋過程及稀釋后使精液pH 發(fā)生巨變，稀釋液中需添加緩沖劑來維持酸堿度的相對穩(wěn)定，維持精子生存環(huán)境的相對穩(wěn)定，防止精子因過酸而死亡。稀釋液中可用的緩沖劑有檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、HEPES（4－羥乙基哌嗪乙磺酸）等。其中Tris的緩沖效果最好，Tris不僅有良好的緩沖性，而且高濃度對精子的毒性也很低［5］。HCO3－過量可能使精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變誘發(fā)獲能［6］，HEPES 等兩性有機(jī)物可以鏊合部分有害金屬離子，緩沖能力較其他緩沖劑強(qiáng)且不受溫度影響［7］。Newth 等［8］認(rèn)為現(xiàn)配稀釋液pH 在60～90min內(nèi)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化，不同稀釋液的pH 變化規(guī)律相異。

2.3 卵黃

生存環(huán)境溫度的降低會(huì)使精子受到冷打擊而休克，失去受精能力。卵黃被用作常規(guī)保護(hù)劑廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物的精液稀釋，低溫保存時(shí)向稀釋液添加卵黃可以對精子提供熱保護(hù)，而茆達(dá)干等［9］認(rèn)為添加卵黃會(huì)使波爾山羊精液保存時(shí)間縮短，卵黃對羊精子有一定的副作用。卵黃作為動(dòng)物源性的添加劑，必然不可避免微生物的污染，另外山羊精清中含有卵黃凝集因子，與卵黃產(chǎn)生凝集作用。因此在山羊精液保存中應(yīng)合理添加卵黃，大量研究顯示將卵黃濃度從20%下降至5%不會(huì)影響受胎率，而進(jìn)一步降低卵黃濃度，受胎率將會(huì)下降［10］。卵黃中為精子提供保護(hù)的主要物質(zhì)是卵磷脂（PC），PC 熔點(diǎn)低，低溫不易凍結(jié)，保護(hù)精子生存，還有改善細(xì)胞脂類代謝，提高細(xì)胞抗氧化能量等多重優(yōu)點(diǎn)。胡傳水等［11］用大豆卵磷脂代替卵黃后保存豬精液，結(jié)果表明以1.5%卵磷脂效果最佳。奶類也是常用低溫保護(hù)劑，研究發(fā)現(xiàn)，綿羊精液液態(tài)2～5 ℃保存條件下，脫脂乳的效果優(yōu)于全乳，若在脫脂乳類稀釋液中添加1%的葡萄糖和5%的卵黃可提高精子活力，而脫脂乳保存的精液要保證好的受胎率則須在8～10h內(nèi)輸完精［12］。

2.4 抗生素

一般情況下，新鮮精液基本無菌，但在稀釋過程中無可避免的會(huì)引入一些雜菌，細(xì)菌的污染會(huì)造成精子凝集、頂體破壞、pH 下降等一系列不利影響。添加適量抗生素可改善精液保存效果，提高受胎率。傳統(tǒng)的稀釋液以使用青霉素為主流，后來研究認(rèn)為青霉素與鏈霉素聯(lián)合使用效果更佳。另有研究指出，精液保存時(shí)可能造成影響的細(xì)菌種類繁多以大腸桿菌危害最甚，其能使精子短時(shí)間內(nèi)失活，還會(huì)破壞頂體質(zhì)膜［13］，而青、鏈霉素對革蘭氏陽性菌抑殺效果顯著，對大腸桿菌卻沒有效果。吳結(jié)革等［14］研究證實(shí)，用恩諾沙星保存精液的效果確實(shí)比使用青、鏈霉素等效果好，其適宜使用量為50μg／mL。

2.5 抗氧化物

抗氧化劑在精液保存中發(fā)揮的作用越來越引起人們關(guān)注。精子區(qū)別于其他細(xì)胞，胞內(nèi)缺乏抗氧化物質(zhì)，精子質(zhì)膜中又沒有足夠的脂肪酸類物質(zhì)，致使精子易受氧化損傷，精液稀釋保存操作過程中，有氧和可見光環(huán)境加速氧化作用，精子活力和質(zhì)膜完整率受到影響，此時(shí)添加抗氧化物可以有效克制這種損傷［15］。在稀釋液中添加褪黑激素（MLT）和超氧化物歧化酶（SOD），能夠延長精子存活時(shí)間，過氧化氫酶（CAT）提高山羊精子膜完整率和頂體完整率［16］。孫琪［17］研究表明，在稀釋液中添加適量的谷胱甘肽（GSH）、褪黑激素（MLT）、丁羥甲苯（BHT）均能提高豬精液的保存效果。

2.6 其他成分

血清蛋白（BSA）是一種蛋白類保護(hù)劑，能有效地延長精液保存時(shí)間，提高保存后精子的受精能力。Matsuoka等［18］研究羊精液冷凍保存表明，用10%～15%的BSA 能起到跟卵黃相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。趙本田等［2］研究認(rèn)為，含5% PVA（聚乙烯醇）的稀釋液有利于精液保存，PVA 的烯醇式結(jié)構(gòu)與水分子氫形成氫鍵，改變液體表面張力，利于平衡精子質(zhì)膜內(nèi)外的作用力。Ca2＋內(nèi)流能引起頂體反應(yīng)，啟動(dòng)精子獲能，不利于保存，故配制稀釋液應(yīng)使用去離子水，同時(shí)也可添加適量EDTA 等螯合劑減少稀釋液中的有害金屬離子［19］。陳宗明等［20］研究了維生素C對貴州黑山羊低溫保存精液品質(zhì)的影響，添加維生素C 3.0mg／mL 時(shí)，可以顯著提高貴州黑山羊的精液品質(zhì)，張培松等［21］用維生素B12稀釋小尾寒羊精液，5～10 ℃下保存，發(fā)現(xiàn)維生素B12能顯著提高精子的有效存活時(shí)間，精子有效存活時(shí)間（活力高于0.6）和最長存活時(shí)間（90%精子死亡時(shí)間）特別是以1∶3比例稀釋時(shí)可以分別達(dá)到22h 和49h 而不含維生素B12的稀釋液有效存活時(shí)間和最長存活時(shí)間僅為7h 和17h。

3 精液稀釋倍數(shù)

精液稀釋時(shí)使小分子蛋白、自然抗氧化劑、脂肪酸類物質(zhì)等重要成分的濃度降低，導(dǎo)致精子聚集、結(jié)構(gòu)受損，縮短精液保存時(shí)間，高倍稀釋后對精子的存活時(shí)間、受精能力都有不良影響［22］。但稀釋精液能使其中抑制精子獲能的物質(zhì)濃度降低，有利于精子獲能。王柏山等［23］研究表明，稀釋倍數(shù)在10 倍以下，可以獲得比較高的受胎率，7、10倍稀釋與原精液受胎率差異都不顯著，15倍稀釋與原精液受胎率差異極顯著，一次輸入有效精子數(shù)30×106個(gè)以上受胎效果好。李助南等［24］研究表明，山羊精液稀釋倍數(shù)應(yīng)以2～5倍為宜；徐振軍等［25］采取6～8倍稀釋，并未出現(xiàn)不良影響；劉福元等研究報(bào)導(dǎo)精液保存以8倍稀釋為佳［26］。

4 存在問題與展望

山羊的繁殖具有明顯的季節(jié)性，如果生產(chǎn)中不使用激素進(jìn)行同期發(fā)情處理，則羊的發(fā)情不集中，繁殖周期拉長，采集羊精液麻煩，使用液態(tài)精液保存是克服這一矛盾最便捷的辦法。用液態(tài)低溫保存精液，由于保存簡單，技術(shù)容易掌握，因而其具有廣闊的應(yīng)用前景。

山羊精液低溫保存技術(shù)雖然已進(jìn)入應(yīng)用階段，然而保存稀釋液的配方不盡完美，保存方法不夠完善，精液在保存過程中其活力和受精能力受到諸多因素的影響，如氧化損傷、代謝酸化、DNA 斷裂、精子質(zhì)膜蛋白和脂類組分發(fā)生變化、頂體反應(yīng)以及自發(fā)獲能等，導(dǎo)致精液的保存時(shí)間短，人工授精受胎率低，該技術(shù)的優(yōu)勢未能得到長足的發(fā)揮，極大程度的限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，深入研究羊精液保存技術(shù)，開發(fā)新型稀釋液配方，減少精液保存過程對精子的損傷，以構(gòu)建更適宜精液體外生活的環(huán)境。

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