家蠅抗藥性的分子機(jī)制：乙酰膽堿酯酶介導(dǎo)的抗藥性*

邱星輝

(中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100101)

突觸乙酰膽堿酯酶Acetylcholinesterase(AchE, EC 3.1.1.7) 是生物神經(jīng)傳導(dǎo)行為中的一個(gè)重要酶，通過(guò)快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine, Ach), 終止神經(jīng)沖動(dòng)以保持正常的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)。該酶促水解反應(yīng)在生物體中非?？焖?，這也提示該酶活性的降低極有可能帶來(lái)顯著的適合度代價(jià)。AChE酶是有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的主要作用靶標(biāo)，有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑作為不可逆抑制劑通過(guò)抑制昆蟲乙酰膽堿的活性，降低其對(duì)乙酰膽堿的水解活性，使神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在突觸處積累，從而破壞正常的神經(jīng)傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致昆蟲的死亡。

自上世紀(jì)60年代開(kāi)始，作用于乙酰膽堿酯酶的有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類化合物被用于許多重要的農(nóng)業(yè)和人畜疾病傳媒昆蟲(如家蠅)的控制。使用這些類型的殺蟲劑之后不久，家蠅抗藥性事例不斷出現(xiàn)，至今家蠅對(duì)常用有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑抗性已是普遍現(xiàn)象，成為家蠅控制工作的一大障礙。以1970年采集后經(jīng)殺蟲威(Tetrachlorvivphos)篩選的Cornell-R品系家蠅為材料獲得的生物化學(xué)數(shù)據(jù)首次證明了乙酰膽堿酯對(duì)殺蟲劑的不敏感性是有機(jī)磷抗性的一個(gè)重要因素(Tripathietal., 1973)，隨后的遺傳學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究進(jìn)一步揭示了乙酰膽堿酯酶介導(dǎo)抗性的分子基礎(chǔ)?，F(xiàn)就這一領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展從3個(gè)方面綜合介紹如下。

1 家蠅乙酰膽堿酯酶抗性相關(guān)的遺傳變異及其進(jìn)化起源

家蠅基因組發(fā)現(xiàn)了單一的乙酰膽堿酯酶基因(mdace)，位于常染色體2上, 編碼由692或693個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白, 其N-端信號(hào)肽序列被切除后形成含612氨基酸殘基的成熟蛋白(Kozakietal., 2001；Kimetal., 2003)。本文敘述的氨基酸位點(diǎn)是以AchE成熟蛋白的氨基酸殘基編號(hào)。

與敏感家蠅相比，從抗性家蠅的mdace基因鑒定出多個(gè)不同位點(diǎn)的點(diǎn)突變。Kim 等(2003)發(fā)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲(Trichlorphon)表現(xiàn)抗性的家蠅的mdace基因編碼的蛋白除3個(gè)點(diǎn)突變外(I82M、G262A、F327Y), 其蛋白序列的其他氨基酸殘基與敏感家蠅相同。Kristensen等(2006)分析了21個(gè)田間種群和9個(gè)實(shí)驗(yàn)室種群，共鑒定出10個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)(I82M、T180L、T230M、 G262A、 G262V、 F327Y、 G365A、 A583D、 A596T、 L597V),其中7個(gè)氨基酸替換(I82M、T180L、 T230M、 G262A、 G262V、 F327Y、 G365A)發(fā)生在活性中心或其附近，推測(cè)其中V180L、 G262A、 G262V、 F327Y 和 G365A 5個(gè)氨基酸替換可導(dǎo)致抗性，而I82M和T230M對(duì)抗藥性的貢獻(xiàn)不大。Kozaki 等(2009) 除發(fā)現(xiàn)V180L、 G262A/V、 F327Y突變外，還發(fā)現(xiàn)另一抗性相關(guān)的氨基酸替換(A236S)。在我國(guó)，從2003年上海采集的經(jīng)殘殺威(Propoxur)和滅多威(Methomyl)篩選的抗性品系中鑒定了5個(gè)突變(P118S、V180L、 G262A、 F327Y)(Taoetal., 2006)，從2009年廣東、上海、山東、北京和吉林5個(gè)省市采集的野生家蠅中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)抗性變異點(diǎn)突變(V180L、G262A/V 和F327Y) (Wangetal., 2012)。

生物化學(xué)證據(jù)顯示某些位點(diǎn)的氨基酸殘基替換可以導(dǎo)致一定程度的乙酰膽堿酯酶對(duì)殺蟲劑的不敏感性(Walshetal., 2001)。如乙酰膽堿酯酶G262A突變體對(duì)敵敵畏的敏感性下降4.3倍；G262V 突變效應(yīng)更強(qiáng)，突變體對(duì)敵敵畏和bendiocard的敏感性分別下降了58和100倍(Walshetal., 2001)。反過(guò)來(lái)，262A和327Y分別定點(diǎn)突變?yōu)?62G和327F可以很大程度地恢復(fù)乙酰膽堿酯酶對(duì)殺蟲劑的敏感性，表明該兩個(gè)氨基酸殘基是決定乙酰膽堿酯酶敏感性的關(guān)鍵位點(diǎn)(Kimetal., 2003)。除這些氨基酸殘基外，在乙酰膽堿酯酶的保守序列(FGESAG)中的谷氨酸(E-234)和丙氨酸(A-236)被認(rèn)為在調(diào)節(jié)對(duì)有機(jī)磷的敏感性方面發(fā)揮作用(Kimetal., 2003)。對(duì)20頭家蠅的基因型和AchE活性的抑制相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，G262A/V 和F327Y與家蠅對(duì)殺螟氧磷(Fenitroxon)的不敏感性相關(guān),另外兩個(gè)點(diǎn)突變 I82M和V180L, 對(duì)不敏感性沒(méi)有明顯的效應(yīng)(Kozakietal., 2001)。A236S變異對(duì)不敏感性的效用還不清楚。

氨基酸替換對(duì)抗性的貢獻(xiàn)與該氨基酸殘基的空間位置和大小有關(guān)。家蠅乙酰膽堿酯酶180位的氨基酸殘基距離催化中心較遠(yuǎn)，對(duì)抗性的貢獻(xiàn)不大(Walshetal., 2001)。262位的甘氨酸(G)在不同物種中的乙酰膽堿酯酶中是保守的，在空間結(jié)構(gòu)上與活性位點(diǎn)235的絲氨酸(S-235)距離很近，說(shuō)明其在維持酶的構(gòu)象和活性中具有重要的地位(Walshetal., 2001)。甘氨酸的R基團(tuán)為H, 該氨基酸如突變?yōu)楸彼?A)或纈氨酸(V)則引入更大的R基團(tuán)(甲基或異丙基)，會(huì)對(duì)S-235產(chǎn)生作用力，從而改變酶活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，繼而改變酶的活性。相對(duì)于丙氨酸，纈氨酸具有更大且疏水的基團(tuán)，推測(cè)G262V突變的效應(yīng)比G262A更加強(qiáng)烈，這一推測(cè)得到了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持(Walshetal., 2001)。365位點(diǎn)的氨基酸與催化三連體的E-364相連，推測(cè)對(duì)酶活性也將產(chǎn)生影響(Walshetal., 2001)。327位點(diǎn)的氨基酸殘基臨近乙酰膽堿酯酶與底物結(jié)合的乙?；阴Ｄ憠A酯酶抗性突變體327位的R基團(tuán)為酪氨酸，相比對(duì)應(yīng)的敏感體的苯丙氨酸多了一個(gè)羥基，可以降低乙酰膽堿酯酶的?；?結(jié)合袋的空間，從而改變?cè)撁傅拇x活性(Walshetal., 2001)。

乙酰膽堿酯酶氨基酸替換可能降低酶的穩(wěn)定性，且多重替換的效用是累加的(Shietal., 2004)。在所有的研究案例中，多突變組合導(dǎo)致更高水平的抗性，但組合效應(yīng)并不是每個(gè)突變效應(yīng)的簡(jiǎn)單疊加(Walshetal., 2001)。單一突變賦予對(duì)大多數(shù)殺蟲劑的抗性，同時(shí)也造成對(duì)少數(shù)殺蟲劑的敏感性，突變組合會(huì)消除這種負(fù)交互抗性，而使昆蟲對(duì)所有殺蟲劑產(chǎn)生抗性，只是抗性程度有所不同(Fournier, 2005)。

系統(tǒng)樹分析顯示，家蠅AChE抗性相關(guān)的氨基酸替換G262A和F327Y有多重的進(jìn)化起源，V180L、A236S、G262V 進(jìn)化起源單一，F(xiàn)327Y和G362A是V180L和 A236S的共同的進(jìn)化前體 (Kozakietal., 2009)。

2 家蠅乙酰膽堿酯酶等位基因的多樣性與分布

基因測(cè)序分析表明，mdace在大多數(shù)品系(或種群)中都包含多個(gè)等位基因。多個(gè)等位基因并存反映出殺蟲劑使用的多重性。Kozaki 等(2009)分析了13個(gè)來(lái)源于北美、歐洲和亞洲的實(shí)驗(yàn)室種群，鑒定出15個(gè)不同的等位基因,其中11個(gè)為敏感等位基因(編碼V180-A236-G262-F327)，4個(gè)為不敏感等基因(v10: V180-A236-A232-Y407; v11: V180-S236-A232-Y407; v14: V180-A236-V232-Y407; v15: L180-A236-A232-Y407)。大多數(shù)品系為雜合品系，包含2個(gè)或2個(gè)以上等位基因,但LPR 和 rspin品系為抗性純合(V180-A236-A262-Y407)。 通過(guò)對(duì)2002年采集于New York州(53只)和Florida(62只)的野外家蠅的檢測(cè)，只發(fā)現(xiàn)一種不敏感等位基因(v10=Ace1),其他等位基因?yàn)槊舾械任换?Aces)，種群中存在3種基因型的個(gè)體，即Aces/Aces,Aces/Ace1和Ace1/Ace1(Kozakietal.,2009)，其中大多數(shù)個(gè)體為雜合基因型(敏感純合基因型的個(gè)體很少)，種群偏離Castle-Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明雜合子具有適合度方面的優(yōu)勢(shì)。

抗性等位基因可能出現(xiàn)生態(tài)演替。例如，雖然在2002年野外采集的家蠅中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)v10之外的其他抗性等位基因，但v11在1980年從New York州采集、v14在1998年Georgia州采集的家蠅品系中檢測(cè)到(Kozakietal.,2009)，這可能是因?yàn)槟承⑾x劑不再使用，從而降低了對(duì)v11和v14抗性等位基因的選擇壓，導(dǎo)致這些等位基因頻率下降的緣故。

mdace等位基因的分布因地區(qū)而不同，但也有重疊。比如，抗性等位基因v10和v11在美國(guó)家蠅中存在，但在來(lái)源于歐洲的田間或?qū)嶒?yàn)室品系未發(fā)現(xiàn)；等位基因v15在一些日本品系中存在，在美國(guó)的野生種群中卻沒(méi)有檢測(cè)到(Kozakietal.,2009)。值得注意的是，在我國(guó)5個(gè)省市采集的樣品中沒(méi)有一個(gè)是敏感純合基因型個(gè)體,其中327Y突變的頻率幾乎達(dá)到100%(Wangetal.,2012)。 我國(guó)家蠅呈現(xiàn)6種不同的mdace基因點(diǎn)突變組合，以組合1 (260L-342A-407Y) 和組合5(260V/L-342A/V-407Y)最為普遍(Wangetal.,2012)，其中組合1也見(jiàn)于1991年英國(guó)采集的一個(gè)品系(77M)中，該品系表現(xiàn)出48倍的對(duì)敵敵畏的不敏感性(Walshetal., 2001)。

3 家蠅乙酰膽堿酯酶抗性變異的分子檢測(cè)方法

家蠅乙酰膽堿酯酶抗性突變?cè)谠砩峡梢酝ㄟ^(guò)基因測(cè)序的方法，也可以通過(guò)其他基因分型的方法來(lái)檢測(cè)。筆者實(shí)驗(yàn)室建立了PCR-RFLP方法，可用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)抗藥性中起關(guān)鍵作用的262位的基因型(Qiuetal., 2012)。該方法的原理是通過(guò)ace基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出大小約609 bp的產(chǎn)物；再分別用限制性內(nèi)切酶Bsp1286I 和 Eae I來(lái)酶解PCR產(chǎn)物；根據(jù)兩個(gè)酶切反應(yīng)的酶酶圖譜可以很好地區(qū)分家蠅個(gè)體乙酰膽堿酯酶基因的基因型(Qiuetal., 2012)。

4 結(jié)語(yǔ)

抗性家蠅mdace基因的非中性突變(Non-neutral mutations)導(dǎo)致其編碼的乙酰膽堿酯酶發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替換，這些替換單獨(dú)或聯(lián)合效應(yīng)賦予家蠅具有不同的殺蟲劑抗性譜(Kozakietal. , 2001)。抗性家蠅種群中乙酰膽堿酯酶普遍存在G262A/V和F327Y突變，表明該兩位點(diǎn)上的氨基酸殘基在抗性進(jìn)化過(guò)程中起著重要的作用。氨基酸殘基G262和F327靠近AchE的活性位點(diǎn)三聯(lián)體(triad, 即S235-E346-H447), G262A/V點(diǎn)突變被認(rèn)為可以通過(guò)改變起催化作用的絲氨酸的定位，F(xiàn)327Y則通過(guò)降低?；?結(jié)合袋的空間來(lái)改變酶的活性(Muteroetal., 1994)。家蠅的不同抗性種群具有相同的遺傳突變表明該類抗性進(jìn)化機(jī)制的保守性。多種不同抗性等位基因共存于家蠅種群中反映了殺蟲劑使用的多重性，也意味著逆轉(zhuǎn)抗性是非常困難的。更深入分析各點(diǎn)突變及突變組合對(duì)乙酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的不敏感性的貢獻(xiàn)，加強(qiáng)抗性等位基因頻率及其擴(kuò)散途徑的監(jiān)測(cè)具有重要的意義。