液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥復(fù)方分析中的應(yīng)用

朱鶴云，關(guān) 皎 (吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

中藥復(fù)方指由兩味或兩味以上藥味組成，具有相對(duì)規(guī)定性的加工方法和使用方法，針對(duì)相對(duì)確定的病證而設(shè)的方劑，其特點(diǎn)為多組分、多靶點(diǎn)同時(shí)作用，達(dá)到整體協(xié)同作用的結(jié)果［1］。中藥復(fù)方復(fù)雜體系的成分分析，是中藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分，對(duì)于闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，具有十分重要的意義。鑒于中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性和多樣性，近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS)技術(shù)越來越多應(yīng)用于中藥復(fù)方的分析。LC-MS技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一門綜合性分析技術(shù)，它集液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的強(qiáng)鑒定能力于一體，對(duì)研究對(duì)象不僅有足夠的靈敏度、選擇性，同時(shí)還能夠給出豐富的結(jié)構(gòu)信息，分析快速而且方便，目前已成為中藥復(fù)方研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的分析工具，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的質(zhì)量控制、藥代動(dòng)力學(xué)和代謝組學(xué)等眾多領(lǐng)域，極大地推動(dòng)了中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。本文對(duì)近5年來國內(nèi)外LC-MS技術(shù)在中藥復(fù)方分析中的應(yīng)用進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在為藥學(xué)工作者更好的利用LC-MS技術(shù)進(jìn)行中藥復(fù)方的研究提供參考。

1 中藥復(fù)方的質(zhì)量控制研究

中藥復(fù)方中包含多種中藥材，這些中藥材又含有大量不同類別、不同極性的化合物，因此，相對(duì)于單一中藥材的質(zhì)量控制而言，中藥復(fù)方的質(zhì)量控制更加復(fù)雜多樣。目前，LC-MS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的化學(xué)成分鑒定、有效成分含量測定及指紋圖譜研究等領(lǐng)域，發(fā)揮越來越重要的作用。近年來，隨著超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)的出現(xiàn)，使得色譜分析實(shí)現(xiàn)了高速度、高靈敏度和高分辨率。其與高分辨質(zhì)譜如TOFMS的聯(lián)用，為中藥復(fù)雜體系研究提供了革命性的工具。汪航等［2］采用LC-MS/MS法鑒定了中藥復(fù)方梔子大黃湯中30種活性成分，其中包括17種黃酮類成分、5種蒽醌類成分、2種香豆素類成分和6種環(huán)烯醚萜苷類成分，并選擇代表性藥物推斷其質(zhì)譜斷裂特征，該方法適用于復(fù)方中不易獲得對(duì)照品的未知化學(xué)成分的分析。王傲雪等［3］采用UFLC-MS法鑒定了茯苓湯中14種活性成分，并應(yīng)用UFLC-DAD法測定了其中4種活性成分的含量，該研究用于茯苓湯的質(zhì)量控制研究。耿放等［4］建立了UPLC-MS法用于中藥復(fù)方逍遙散的指紋圖譜研究，共標(biāo)定了16個(gè)共有色譜峰，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜信息的比對(duì)，指認(rèn)了其中3個(gè)色譜峰，獲得的指紋圖譜特征性及專屬性強(qiáng)，可用于逍遙散質(zhì)量的控制。目前，LC-MS技術(shù)已成為中藥復(fù)方分析必不可少的工具，具有較好的應(yīng)用前景。

2 中藥復(fù)方的藥代動(dòng)力學(xué)研究

中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)是藥代動(dòng)力學(xué)的延伸和發(fā)展，通過對(duì)復(fù)方藥動(dòng)學(xué)的研究有助于揭示復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)、方劑組方原理、指導(dǎo)臨床合理用藥、促進(jìn)中藥的劑型改革和新藥研發(fā)，對(duì)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化及國際化具有重要意義［5］。目前，血藥濃度法是研究中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)的最常用的方法，該方法準(zhǔn)確、適用性廣，對(duì)于有效成分明確的中藥或中藥復(fù)方，能夠得出準(zhǔn)確的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并且對(duì)于臨床用藥具有較好的指導(dǎo)意義［6］。中藥復(fù)方中化學(xué)成分復(fù)雜且含量差異較大，進(jìn)入體內(nèi)后，原型藥及代謝物在血漿、尿液和膽汁等體液中的含量往往只有ng級(jí)水平，一般的檢測方法如薄層掃描法、高效液相色譜法等難以檢測，而LCMS法只需對(duì)樣品進(jìn)行簡單處理或衍生化就能快速測定，檢測靈敏度和專屬性均較高，適合于中藥復(fù)方的藥代動(dòng)力學(xué)研究，大大推動(dòng)了中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)的發(fā)展。何博賽等［7］建立LC-MS/MS法測定大鼠血漿中棘苷、芒果苷和阿魏酸的濃度，并將該方法應(yīng)用于正常大鼠和失眠大鼠灌胃給予酸棗仁湯后的對(duì)比藥動(dòng)學(xué)研究，棘苷、芒果苷和阿魏酸的定量下限分別為1、6和1 ng/mL，方法的提取回收率均大于85%，結(jié)果表明，阿魏酸在正常組大鼠和失眠組大鼠間的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著性差異，而棘苷和芒果苷在失眠組大鼠體內(nèi)的吸收明顯低于正常組。王瑩等［8］建立了UPLCMS/MS法用于測定大鼠灌胃給予葛根芪連湯后血漿中葛根素、大豆苷元、黃芩苷、次黃芩苷和甘草苷的濃度，葛根素、大豆苷元、黃芩苷、次黃芩苷和甘草苷的提取回收率分別為 79.8%、90.8%、74.4%、70.2%和84.7%，準(zhǔn)確度和精密度均符合要求，該方法成功應(yīng)用于大鼠灌胃給予葛根芪連湯后血漿中5種活性成分的藥動(dòng)學(xué)研究。黃萍等［9］建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測定大鼠血漿中大黃酸、大黃素、小檗堿和黃芩苷的濃度，檢測方式為正離子和負(fù)離子切換的模式。其中，黃芩苷和小檗堿采用正離子方式檢測，大黃酸和大黃素采用負(fù)離子方式檢測，該方法具有較高的靈敏度和較短的分析時(shí)間(7 min)，4種物質(zhì)的線性、準(zhǔn)確度、精密度和提取回收率均滿足要求，該方法成功應(yīng)用于大鼠灌胃給予大黃黃連瀉心湯后的血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究。目前，LC-MS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于中藥復(fù)方的代謝研究，聞曉東等［10］采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀鑒定大鼠灌胃給予補(bǔ)陽還五湯后尿液中的主要代謝產(chǎn)物，大鼠尿液樣品采用固相萃取法進(jìn)行預(yù)處理，檢測時(shí)間為20 min，大鼠尿液中共檢測到50種化合物，其中包括18種原形藥物和32種代謝物。結(jié)果表明，葡萄糖醛酸化和硫酸化是異黃酮類化合物的主要代謝途徑，谷胱甘肽結(jié)合、葡萄糖醛酸化和硫酸化是四氯苯酞的主要代謝途徑，沒有檢測到與皂苷相關(guān)的代謝物。該研究為補(bǔ)陽還五湯的代謝提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，證明了LC-MS技術(shù)可以用于中藥復(fù)方中代謝物的快速鑒定分析。

3 中藥復(fù)方的代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)是通過考察生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)受刺激或擾動(dòng)后(如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后)，其代謝產(chǎn)物的變化或隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)［11］。代謝組學(xué)的研究對(duì)象主要是相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的小分子物質(zhì)。完整的代謝組學(xué)流程包括樣品的采集與制備、代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)志物識(shí)別和途徑分析等步驟。生物樣品可以是血液、尿液、組織、細(xì)胞和培養(yǎng)液等，采集后首先進(jìn)行生物反應(yīng)滅活、預(yù)處理，然后運(yùn)用核磁共振、質(zhì)譜或色譜等手段檢測其中代謝物的種類、含量、狀態(tài)及其變化，得到代謝輪廓或代謝指紋，然后使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對(duì)獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘，識(shí)別出有顯著變化的代謝標(biāo)志物，并研究所涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，以闡述生物體對(duì)相應(yīng)刺激的響應(yīng)機(jī)制，達(dá)到分型和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的目的［12］。代謝組學(xué)力求分析生物體系中的所有代謝產(chǎn)物，整個(gè)分析應(yīng)盡可能保留和反映總的代謝產(chǎn)物的信息。目前，LC-MS技術(shù)在中藥復(fù)方代謝組學(xué)的分析研究中發(fā)揮重要的作用。姜鵬等［13］采用LC-Q-TOF-MS技術(shù)研究了心肌梗死前期大鼠血清中的主要生物標(biāo)記物以及麝香保心丸對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用，在心肌梗死大鼠的血清中共指認(rèn)出14種生物標(biāo)記物，通過分析這些生物標(biāo)記物，炎癥、肥大和氧化性損傷被認(rèn)為是早期心肌梗死關(guān)系最密切的組織病理學(xué)改變，通過鑒定這些主要的生物標(biāo)記物不僅可以為早期心肌梗死的進(jìn)展提供系統(tǒng)性的信息，而且還可以為早期心肌梗死的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，麝香保心丸可以通過調(diào)節(jié)類固醇激素的生物合成途徑來起到對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用。楊波等［14］采用UPLC-Q-TOF法研究了失眠癥的代謝組學(xué)以及酸棗仁湯對(duì)于失眠癥的干預(yù)作用，該研究可用于失眠癥的吸收和代謝特征研究，包括主成分分析、偏最小二乘-判別分析、正交偏最小二乘-判別分析模式等模式識(shí)別方法用于研究代謝物的結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)新的代謝物，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)差異性代謝產(chǎn)物，這些代謝物的變化與氨基酸和脂肪酸的代謝密切相關(guān)。結(jié)果表明，酸棗仁湯可能通過調(diào)節(jié)血清素能的激活發(fā)揮治療作用，UPLC-Q-TOF法適合用于傳統(tǒng)中藥的代謝輪廓分析。

4 結(jié)語

中藥復(fù)方是祖國醫(yī)學(xué)幾千年臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，是我國醫(yī)學(xué)的瑰寶，但是中藥復(fù)方活性成分復(fù)雜、代謝物在生物樣品中濃度較低，且生物樣品內(nèi)源性雜質(zhì)較多，給其研究帶來了相當(dāng)大的困難。隨著商品化超高效液相色譜技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，以及專家系統(tǒng)、譜圖庫的不斷完善，LC-MS技術(shù)在中藥復(fù)方質(zhì)量控制、體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)、藥物代謝和代謝組學(xué)研究中的作用將更加廣泛，也必將大大推動(dòng)中藥復(fù)方研究的現(xiàn)代化進(jìn)程。

［1］焦振廉.試論中藥復(fù)方的開發(fā)研究［J］.陜西中醫(yī)，2004，25(4):357-359.

［2］Wang Hang，F(xiàn)eng Fang.Identification of components in Zhi-Zi-Da-Huang decoction by HPLC coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry，photodiode array and fluorescence detectors［J］.J Pharm Biomed A-nal，2009，49(5):1157-1165.

［3］Wang Aoxue，Ge Guangbo，Qi Xiaoyi，et al.Rapid profiling and target analysis of principal components in Fuling Decoctions by UFLC-DAD-ESI-MS［J］.Fitoterapia，2010，81(6):662-667.

［4］耿 放，鄒韜博，王業(yè)秋，等.逍遙散 UPLC-MS指紋圖譜研究［J］.藥物分析雜志，2013，33(7):1250-1253.

［5］張英豐，董 宇，朱曉新.中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究的方法與思考［J］.中國天然藥物，2008，6(5):321-324.

［6］周 瑩，杜武勛，朱明丹，等.中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究方法進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(5):143-145.

［7］He Bosai，Li Qing，Jia Ying，et al.A UFLC-MS/MS method for simultaneous quantitation of spinosin，mangiferin and ferulic acid in rat plasma:application to a comparative pharmacokinetic study in normal and insomnic rats［J］.J Mass Spectrom，2012，47(10):1333-1340.

［8］Wang Ying，Yao Yamin，An Rui，et al.Simultaneous determination of puerarin，daidzein，baicalin，wogonoside and liquiritin of GegenQinlian decoction in rat plasma by ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877(20/21):1820-1826.

［9］Huang Ping，Gao Jingwen，Shi Zhan，et al.A novel UPLCMS/MS method for simultaneous quantification of rhein，emodin，berberine and baicalin in rat plasma and its application in a pharmacokinetic study［J］.Bioanalysis，2012，4(10):1205-1213.

［10］Wen Xiaodong，Liu Ehu，Yang Jie，et al.Identification of metabolites of Buyang Huanwu decoction in rat urine u-sing liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry［J］.J Pharm Biomed Anal，2012，67/68:114-122.

［11］Nicholson J K，Bollard M E，Lindon J C，et al.Metabonomics:a platform for studying drug toxicity and gene function［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(2):153-160.

［12］許國旺，路 鑫，楊勝利.代謝組學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(6):701-711.

［13］Jiang Peng，Dai Weixing，Yan Shikai，et al.Biomarkers in the early period of acute myocardial infarction in rat serum and protective effects of Shexiang Baoxin Pill using a metabolomic method［J］.J Ethnopharmacol，2011，138(2):530-536.

［14］Yang Bo，Zhang Aihua，Sun Hui，et al.Metabolomic study of insomnia and intervention effects of Suanzaoren decoction using ultra-performance liquid-chromatography/electrospray-ionization synapt high-definition mass spectrometry［J］.J Pharm Biomed Anal，2012，58:113-124.