豬瘟活疫苗外源病毒BVDV細(xì)胞培養(yǎng)與PCR檢測(cè)的比較

尚宏華 郭建平 謝秋梅

（中牧股份江西生物藥廠，江西 南昌 330200）

豬瘟活疫苗外源病毒BVDV細(xì)胞培養(yǎng)與PCR檢測(cè)的比較

尚宏華 郭建平 謝秋梅

（中牧股份江西生物藥廠，江西 南昌 330200）

采用細(xì)胞培養(yǎng)法和PCR方法，一次性對(duì)中股份江西生物藥廠生產(chǎn)的18批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）進(jìn)行了外源病毒BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)兩種方法的檢測(cè)，并進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示：細(xì)胞檢驗(yàn)外源病毒方法除了能用熒光抗體檢測(cè)BVDV外，還能通過致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)檢測(cè)藍(lán)舌病毒、細(xì)小病毒等其它外源病毒；而PCR方法檢測(cè)的是病毒核酸，并不能鑒別病毒活性，另外，由于PCR靈敏度高，容易出現(xiàn)假陽性，如果不對(duì)DNA測(cè)序，可能出現(xiàn)假陽性而導(dǎo)致結(jié)果誤判，給生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬瘟活疫苗；外源病毒；PCR檢測(cè)；比較

為了保證病毒性生物制品安全有效，任何一種生物制品都不允許存在與產(chǎn)品無關(guān)的外源病毒。如果病毒性生物制品攜帶外源病毒，不僅不能有效預(yù)防疾病，甚至還可能成為傳播動(dòng)物疫病的媒介，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于豬瘟活疫苗外源病毒檢驗(yàn)，其檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)已在《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2010年版三部）中有明確的規(guī)定。法定的豬瘟活疫苗外源病毒檢驗(yàn)是通過細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行熒光抗體檢查、致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)來判定有無外源病毒污染[1]。但隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，許多生物制品生產(chǎn)企業(yè)、高等院校、研究所、大型養(yǎng)殖場(chǎng)常用PCR檢測(cè)生物制品外源病毒污染情況。本文采用細(xì)胞培養(yǎng)法和PCR方法，一次性對(duì)本廠生產(chǎn)的18批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）進(jìn)行了BVDV外源病毒兩種方法的檢測(cè)，并進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1綠猴腎（Vero）傳代細(xì)胞、PK-15傳代細(xì)胞、MDBK傳代細(xì)胞。

1.1.2連續(xù)18個(gè)批號(hào)的豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）。

1.1.3主要試劑、儀器。DMEM培養(yǎng)液（（GIBCO））、新生胎牛血清（GIBCO）、BVDV間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒（中監(jiān)所）、BVDV陽性毒株Oregonc24v（中監(jiān)所）、豚鼠紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞、吉姆薩染色液（Sigma）、倒置熒光顯微鏡（日本Olypus），5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO）。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（TIANGEN）、一步法RT-PCR試劑盒（TIANGEN）、PCR儀（美國(guó)ABI）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)法檢驗(yàn)BVDV參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2010年版三部）外源病毒檢驗(yàn)方法[2]。

1.2.1.1樣品處理。每批疫苗樣品取3瓶，用DMEM液按要求稀釋成每毫升10頭份，混勻、混合離心，取上清液作為被檢樣品。

1.2.1.2樣品的接種、培養(yǎng)與檢驗(yàn)。接種1mL已處理被檢樣品至長(zhǎng)成良好單層的Vero、PK-15、MDBK細(xì)胞，另各設(shè)一瓶正常細(xì)胞對(duì)照，細(xì)胞培養(yǎng)5d、10d后反復(fù)凍融細(xì)胞3次，連續(xù)繼代2次。培養(yǎng)期間觀察細(xì)胞病變情況，最后一次繼代的細(xì)胞用熒光抗體檢查法、致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)。

1.2.2外源病毒BVDV PCR檢驗(yàn)是由上海獸醫(yī)研究所提供引物，該廠檢驗(yàn)人員建立的BVDV檢驗(yàn)方法。

1.2.2.1取豬瘟活疫苗3瓶，生理鹽水稀釋后混合、混勻。按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明提取病毒RNA。

1.2.2.2按照一步法RT-PCR試劑盒說明，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，另設(shè)陰陽性對(duì)照。

1.2.2.3電泳、拍照。

2 結(jié)果

2.1外源病毒BVDV細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

Vero、PK-15、MDBK細(xì)胞在接種豬瘟活疫苗后連續(xù)繼代2次，均無細(xì)胞病變。最后一次繼代后的MDBK細(xì)胞用BVDV間接免疫熒光試劑盒染色、鏡檢，結(jié)果除BVDV陽性對(duì)照出現(xiàn)特異性熒光外，所有檢測(cè)樣品均無出現(xiàn)BVDV特異性熒光，Vero、PK-15細(xì)胞分別進(jìn)行致細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)，結(jié)果均無細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。圖1、2、3、4、5、6分別為部分樣品熒光染色、致細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附圖片。

圖1 BVDV陽性對(duì)照熒光染色（100ⅹ）

圖2 接種疫苗樣品熒光染色（100ⅹ）

圖3 正常PK細(xì)胞致細(xì)胞病變（200ⅹ）

圖4 接種疫苗樣品致細(xì)胞病變（200ⅹ）

圖5 正常PK細(xì)胞紅細(xì)胞吸附（200ⅹ）

圖6 接種疫苗樣品紅細(xì)胞吸附（200ⅹ）

2.2外源病毒BVDV PCR檢測(cè)結(jié)果（如圖7）

圖7 21:DNAMarker（DL2000）；20:BVDV陽性對(duì)照；19：陰性對(duì)照；1～18：豬瘟疫苗樣品

被檢疫苗樣品除7、16號(hào)樣品和陽性對(duì)照出現(xiàn)309bp目的條帶，其它樣品及陰性對(duì)照均未檢測(cè)到BVDV。同時(shí)將18批疫苗接種MDBK細(xì)胞，連續(xù)繼代2次，收集BVDV熒光染色時(shí)的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了BVDV的PCR擴(kuò)增，結(jié)果18個(gè)樣品均為陰性。

2.3所有樣品檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 各樣品外源病毒BVDV不同檢測(cè)方法結(jié)果比較

3 討論與分析

在疫苗生產(chǎn)過程中，外源病毒污染主要通過種毒、細(xì)胞、血清、胰酶等生物活性材料以及操作人員、容器、設(shè)備。各批疫苗生產(chǎn)之前，所有活性材料都采用細(xì)胞培養(yǎng)法并結(jié)合PCR檢測(cè)方法對(duì)外源病毒進(jìn)行監(jiān)控，無論是細(xì)胞檢驗(yàn)法還是PCR檢測(cè)陽性的原材料，都將嚴(yán)格按照GMP要求進(jìn)行報(bào)廢處理，從源頭上切斷了外源病毒對(duì)疫苗的污染。整個(gè)生產(chǎn)過程嚴(yán)格按照GMP要求進(jìn)行生產(chǎn)，工藝成熟而穩(wěn)定，減少了人為的操作污染。

在進(jìn)行豬瘟活疫苗外源病毒檢驗(yàn)時(shí)，一次性對(duì)該廠生產(chǎn)的連續(xù)18個(gè)批號(hào)的豬瘟活疫苗外源病毒BVDV進(jìn)行了細(xì)胞檢測(cè)和PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，細(xì)胞檢驗(yàn)外源病毒方法除了能檢測(cè)BVDV外，還能檢測(cè)到其它的藍(lán)舌病毒、細(xì)小病毒等外源病毒。18個(gè)疫苗樣品接種Vero、PK-15和MDBK細(xì)胞后連續(xù)繼代2次，通過熒光抗體檢查、致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)，結(jié)果均無外源病毒污染。而PCR檢驗(yàn)結(jié)果有2個(gè)樣品為BVDV陽性，為進(jìn)一步驗(yàn)證檢驗(yàn)結(jié)果，將疫苗接種細(xì)胞連續(xù)繼代2次后的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物也進(jìn)行了BVDV PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。出現(xiàn)這種結(jié)果，可能有兩種原因，一是疫苗產(chǎn)品中可能存在BVDV病毒核酸，但并不是活病毒，另一種可能是由于PCR靈敏度高而出現(xiàn)的假陽性，理論上這兩種可能都會(huì)導(dǎo)致疫苗直接PCR檢驗(yàn)出現(xiàn)陽性結(jié)果，而經(jīng)過敏感細(xì)胞幾代培養(yǎng)后PCR檢測(cè)出現(xiàn)陰性結(jié)果。

近年來，隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，許多研究人員已經(jīng)將PCR技術(shù)應(yīng)用于BVDV的檢測(cè)，并且取得了一定的成效。但PCR方法從樣品RNA提取、反轉(zhuǎn)錄到PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，全部過程對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，操作要求細(xì)致，否則由于PCR具有高靈敏度容易出現(xiàn)高陽性率，如果對(duì)陽性結(jié)果不做基因測(cè)序，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果偏差。另外，PCR方法的確能快速幫助初步判定產(chǎn)品有無特異性外源病毒污染，但因該法檢驗(yàn)的是病毒核酸，并不能鑒別病毒活性，需要對(duì)基因進(jìn)行測(cè)序，并采用細(xì)胞法檢驗(yàn)其活性，這是PCR檢驗(yàn)生物制品外源病毒存在的局限性。在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，要嚴(yán)格貫徹執(zhí)行2010年版《中國(guó)獸藥典》外源病毒檢驗(yàn)法來判定有無外源病毒污染，PCR檢驗(yàn)只能作為生物制品外源病毒的一種輔助檢驗(yàn)手段。

[1]中華人民共和國(guó)獸藥典[M].2010(第三部).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：附錄40～42.

[2]中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察室.非禽源活疫苗外源病毒檢驗(yàn)技術(shù)[Z].北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2013.

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