人類(lèi)單核苷酸多態(tài)性研究進(jìn)展

蘇 津 綜述，包娜娜，李會(huì)來(lái)，陳占國(guó) 審校（河北省秦皇島市撫寧縣中醫(yī)院 066300）

根據(jù)“人類(lèi)基因組計(jì)劃”，人類(lèi)對(duì)自身基因組中的核苷酸序列進(jìn)行了深入的了解與認(rèn)識(shí)，這個(gè)計(jì)劃的關(guān)鍵目標(biāo)在于尋找功能基因，并且說(shuō)明特定基因組區(qū)域里序列產(chǎn)生的差異［1］。單核苷酸多態(tài)性（SNP）在基因組中的序列差異最為普遍，在多個(gè)學(xué)科的領(lǐng)域中具有重要的意義，發(fā)揮著巨大的作用。SNP指在基因組水平中由單核的苷酸變異引發(fā)DNA的序列產(chǎn)生多態(tài)的變化，在人類(lèi)遺傳變異中最為常見(jiàn)，也是人類(lèi)基因組計(jì)劃后才進(jìn)行研究的最新遺傳標(biāo)記。作者針對(duì)SNP的概念與特性，闡述其研究的價(jià)值與意義，并對(duì)研究方法進(jìn)行綜述，旨在探討SNP在遺傳學(xué)、生物醫(yī)學(xué)以及人類(lèi)進(jìn)化史中發(fā)揮的作用。

1 SNP的概述

SNP作為基因組DNA中單堿基的序列差異，在人群中的分布率占1%以上，但是基因組里其他序列差異導(dǎo)致的變異不屬于SNP范圍，比如重復(fù)、缺失以及插入序列復(fù)制數(shù)目發(fā)生變化［2］。另外，SNP所引起的人類(lèi)遺傳基因多態(tài)性在遺傳信息中的本質(zhì)表現(xiàn)占90%以上。

從生物遺傳的角度來(lái)說(shuō)，SNP特點(diǎn)包括：（1）將兩個(gè)隨機(jī)染色體加以對(duì)比，每一千個(gè)堿基里面就會(huì)有一個(gè)SNP。（2）在基因內(nèi)部中有部分SNP將對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)，或是表達(dá)水平造成直接影響，以利于充分了解疾病的遺傳機(jī)制。（3）在進(jìn)化史中，SNP僅發(fā)生過(guò)一次變異，因此其遺傳特性更加穩(wěn)定。（4）高通量SNP篩選隨著SNP研究成本降低以及研究方法的發(fā)展，將對(duì)遺傳學(xué)分析起到促進(jìn)與推動(dòng)的支持作用［3］。

2 SNP的研究?jī)r(jià)值

2.1 疾病病因在大多數(shù)人的概念中，每一種疾病均可發(fā)現(xiàn)遺傳因素的影子［4］。SNP在基因組中的變異能夠起到兩個(gè)作用，一個(gè)是作為遺傳學(xué)的一種分子標(biāo)記物，另一個(gè)至關(guān)重要的作用就是能表達(dá)出基因和疾病之間的關(guān)系，對(duì)疾病中存在的有關(guān)基因進(jìn)行搜索。對(duì)于部分單基因的遺傳性疾病，采用家系研究方法對(duì)疾病的病因進(jìn)行搜索的應(yīng)用，在目前臨床上已經(jīng)取得了一定的成果。但是，在多基因疾病中，因?yàn)榛驍?shù)目和影響疾病發(fā)生發(fā)展存在的差異，且環(huán)境因素也起到了重要作用，在病因?qū)W研究方面多基因疾病增加了很多的困難。SNP研究的重點(diǎn)為通過(guò)SNP圖譜的構(gòu)建，為尋求和疾病有關(guān)的基因，開(kāi)展全基因方面的研究，在現(xiàn)階段研究里面主要采取的研究方法就是直接法、間接法。直接法通過(guò)尋找cSNPs及基因編碼，獲取對(duì)疾病易感性產(chǎn)生影響的基因序列變異，并且根據(jù)對(duì)現(xiàn)在研究的分析，在人類(lèi)基因序列編碼區(qū)域中cSNPs的數(shù)量只有2、3個(gè)變異，其頻率在10%以上，而編碼區(qū)域內(nèi)并不包括全部的功能性變異，因此不能被廣泛應(yīng)用。間接法所尋找的目標(biāo)就是和致病性相關(guān)的中性多態(tài)位點(diǎn)，而且對(duì)于氨基酸編碼和蛋白的結(jié)構(gòu)不會(huì)被改變，且不會(huì)使表現(xiàn)型改變。但是，在染色體方面有些疾病有關(guān)的基因突變位點(diǎn)將可能發(fā)生連鎖效應(yīng)，甚至還會(huì)遺傳至后代［5］。

2.2 藥物基因組學(xué)人類(lèi)基因組框架序列于2001年建立完成，與此同時(shí)，誕生了以個(gè)體遺傳學(xué)為主，運(yùn)用醫(yī)源性藥物原理，對(duì)患者臨床的藥效和不良反應(yīng)加以評(píng)估的一門(mén)藥物基因組學(xué)［6］。此學(xué)科利用基因組學(xué)的研究技術(shù)，比如生物學(xué)信息、化學(xué)信息、基因圖譜、高通量DNA的檢測(cè)序列，使得研究人員可以針對(duì)個(gè)體和群體間產(chǎn)生的藥效差異予以準(zhǔn)確遺傳學(xué)基礎(chǔ)的定性，主要在于對(duì)特定患者進(jìn)行診療，防止藥物造成不良反應(yīng)及對(duì)藥物靶點(diǎn)加以設(shè)計(jì)。通過(guò)個(gè)體化醫(yī)療手段對(duì)患者用藥起到正面作用，并按照個(gè)體基因型的特異性對(duì)患者進(jìn)行藥物的優(yōu)化配置，使得藥物的臨床療效更為顯著，不良反應(yīng)更小。在藥物基因組研究中，由于SNP位點(diǎn)的差異，將會(huì)對(duì)基因的表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氨基酸的剪切以及編碼產(chǎn)生巨大的影響，進(jìn)而改變藥物與受體以及轉(zhuǎn)運(yùn)體之間的相互作用，影響藥物代謝［7］。在不斷構(gòu)建高密度SNP及相關(guān)藥物代謝的SNP圖譜的情況下，醫(yī)生了解患者基因型后，認(rèn)真對(duì)患者遺傳檔案加以分析，并對(duì)患者進(jìn)行適宜藥物的應(yīng)用，以此避免藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)。目前，臨床所采用的藥物應(yīng)用條件需要根據(jù)患者的體質(zhì)量、年齡等資料加以確定，而在未來(lái)發(fā)展過(guò)程中，此方法會(huì)逐漸由個(gè)體遺傳信息取代。

2.3 人類(lèi)進(jìn)化史由于SNP對(duì)進(jìn)化水平的變異有所體現(xiàn)，因此也可以對(duì)種群間的DNA序列變異進(jìn)行研究。大多數(shù)SNP在基因組在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域之外，如分布方面是不會(huì)受到選擇的干擾，而且會(huì)長(zhǎng)期保留下來(lái)。一些對(duì)蛋白編碼區(qū)域內(nèi)的表現(xiàn)型SNP產(chǎn)生影響，雖然會(huì)受到自然選擇施加的壓力，但若是可以長(zhǎng)時(shí)間被保留下來(lái)，就能夠?qū)€(gè)體成功繁衍后代發(fā)揮促進(jìn)作用，充分說(shuō)明這些變異會(huì)受到選擇的干擾，而且還會(huì)作為代表成為進(jìn)化史中的部分關(guān)鍵事件［9］。所以，根據(jù)對(duì)不同物種相互之間的蛋白編碼及非編碼區(qū)和變異數(shù)目得出的比值予以計(jì)算，能夠?qū)M(jìn)化樹(shù)當(dāng)中的分支點(diǎn)加以追溯，還能促進(jìn)進(jìn)化，并產(chǎn)生積極影響的變異，這樣才可以在基因池中被固定保留。

3 研究方法與技術(shù)手段

在目前的SNP研究期間，很多技術(shù)會(huì)隨生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展而加以應(yīng)用，具體表現(xiàn)為下面幾方面。

3.1 微陣列雜交實(shí)驗(yàn)在SNP研究中可以將雜交實(shí)驗(yàn)方法作為研究的基礎(chǔ)理論［10］。將SNP位點(diǎn)作為中心，再向兩側(cè)延伸10～20個(gè)堿基作為位點(diǎn)特異性探針，然后雜交包括該位點(diǎn)不同個(gè)體產(chǎn)生聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的物質(zhì)。該特異性探針具有較小的長(zhǎng)度，所以可以對(duì)含有SNP位點(diǎn)堿基和靶DNA相匹配，從而對(duì)形成探針，也就是靶DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生關(guān)鍵作用，同時(shí)據(jù)此對(duì)不同個(gè)體位于此位點(diǎn)時(shí)表現(xiàn)的不同基因型加以辨別和對(duì)比。這種實(shí)驗(yàn)方法具體有兩種模式，第一種適用于在規(guī)模較大的人群當(dāng)中對(duì)少量SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，方法為將待測(cè)的DNA樣品進(jìn)行固定；第二種可于同一時(shí)間對(duì)大批量SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一分析，方法為采用微陣列將高密度探針在基片上進(jìn)行固定，并且要制備數(shù)萬(wàn)個(gè)和ASO雜交以后PCR產(chǎn)物。如果可以實(shí)現(xiàn)這樣的操作，應(yīng)該將每個(gè)SNP位點(diǎn)之間所產(chǎn)生的PCR盡可能縮短，保證能夠?qū)崿F(xiàn)多重PCR。而且在PCR引物中應(yīng)該存在通用尾巴，以利于二次擴(kuò)增時(shí)，增加引物的使用效率，提高不同產(chǎn)物PCR的相似率［11］。當(dāng)擴(kuò)增完成以后，將點(diǎn)有ASO的基因芯片與包含多個(gè)SNP位點(diǎn)或是多重混合物的不同樣品實(shí)驗(yàn)雜交，同時(shí)利用共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)熒光信號(hào)并記錄，根據(jù)樣本間的對(duì)比及對(duì)照成像對(duì)雜交結(jié)果詳盡分析。此方法的問(wèn)題主要是多重PCR具有一定程度的局限性，還有就是很多DNA樣本和ASO探針相雜交時(shí)存在的復(fù)雜性及設(shè)備與設(shè)計(jì)高密度芯片的問(wèn)題。

3.2 分子燈塔這項(xiàng)技術(shù)基于PCR反應(yīng)對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，并需要由3個(gè)部分組成的雜交探針，兩端為由熒光染料進(jìn)行標(biāo)記并可以參照SNP位點(diǎn)堿基的變化進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記的DNA序列，中間為SNP位點(diǎn)的特異性序列。如果探針沒(méi)有和序列實(shí)施特異性雜交的情況下，探針兩端序列可以互補(bǔ)，從而產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)，致使兩側(cè)熒光材料因?yàn)檫^(guò)度緊密而發(fā)生熒光淬滅的現(xiàn)象［12］。如果探針和序列在特異性雜交的情況下，兩種染料各自分離，致使熒光強(qiáng)度變?yōu)殡s交前的900倍以上。此種方法比較簡(jiǎn)單便捷，但是探針雜交的穩(wěn)定性卻不能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的預(yù)期效果。

3.3 測(cè)序這種方法為國(guó)際上應(yīng)用最為廣泛的SNP研究方法，具有直接、準(zhǔn)確對(duì)序列差異進(jìn)行反映、檢測(cè)成本逐漸降低等優(yōu)勢(shì)。常用的手段就是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序和隨機(jī)性測(cè)序。

3.3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 該種手段經(jīng)常被應(yīng)用于驗(yàn)證及發(fā)現(xiàn)SNP中，利用PCR把可能調(diào)控區(qū)域和編碼區(qū)域里面的序列表現(xiàn)于不同個(gè)體中加以擴(kuò)增以后，再對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物予以序列或是測(cè)序分析。這種方法僅對(duì)已知序列組區(qū)域內(nèi)的SNP開(kāi)展研究，成本比較昂貴且操作復(fù)雜，也不適合對(duì)SNP進(jìn)行大規(guī)模的篩選。

3.3.2 隨機(jī)測(cè)序 這種策略在目前的研究中流行兩種方法，基因組比與不完全鳥(niǎo)槍法。前者采取的方法為對(duì)全基因組進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，并將其與人類(lèi)基因組序列進(jìn)行對(duì)比，將新發(fā)現(xiàn)的SNP在全基因組的序列圖譜中進(jìn)行定位。缺點(diǎn)在于，在發(fā)現(xiàn)SNP的結(jié)果僅為2條染色體序列之間的比較，易導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析時(shí)隨機(jī)誤差的產(chǎn)生和引入測(cè)序錯(cuò)誤的出現(xiàn)，致使其產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。不完全鳥(niǎo)槍法關(guān)鍵是把不同個(gè)體內(nèi)的DNA樣品加以等量混合以后再構(gòu)建基因文庫(kù)［13］。隨機(jī)性把全基因組核苷酸序列打斷為基礎(chǔ)，獲取全基因組內(nèi)的微量片段，然后對(duì)其采取隨機(jī)測(cè)序，以至于其可以成倍的覆蓋，從而在不同顏色體間相互重疊的區(qū)域?qū)π蛄胁町惣右则?yàn)證和發(fā)現(xiàn)，以利于搜索一些人群中的SNP。通常情況下，若是想把基因組內(nèi)的部分區(qū)域取得比較大的覆蓋度，這就需要進(jìn)行大量的測(cè)序反應(yīng)達(dá)到目的，但是因?yàn)殡S機(jī)測(cè)序方法內(nèi)SNP選自不同個(gè)體構(gòu)建的群體樣品，加強(qiáng)了結(jié)果的可信度。

4 人類(lèi)單核苷酸多態(tài)性的研究現(xiàn)狀

根據(jù)現(xiàn)階段國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，SNP的試驗(yàn)研究可以分為3個(gè)階段，分別是發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證及篩選。而現(xiàn)在研究的重點(diǎn)傾向于第一個(gè)階段，而這一階段只能夠獲得與SNP有關(guān)的少量信息，例如多態(tài)位點(diǎn)在基因當(dāng)中、染色體當(dāng)中的定位，以及堿基的變異等。對(duì)于這個(gè)階段得到的SNP，還要在小規(guī)模人群中進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)SNP的分布頻率對(duì)常見(jiàn)或稀有的類(lèi)型進(jìn)行判斷，以此來(lái)避免數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)處理等方面產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果［14］。下一步實(shí)驗(yàn)研究將選擇更廣闊的人群對(duì)SNP進(jìn)行掃描，進(jìn)一步確定不同人群中SNP的分布情況，同時(shí)尋找更低頻率的SNP。對(duì)于不同人群之間的關(guān)系以及遷移情況，SNP的分布頻率尤其是稀有SNP能夠起到重要的提示作用。按照進(jìn)化的觀點(diǎn)可以總結(jié)出一個(gè)結(jié)論，常見(jiàn)SNP表明了變異相當(dāng)久遠(yuǎn)，在人群中長(zhǎng)久的保存下來(lái)，而且以固定的頻率存在著；稀有的SNP表明，人群會(huì)在近期內(nèi)出現(xiàn)變化。

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