骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨中線粒體酶表達的變化

錢煒，Bipin Kumar Rai，袁即山，劉嫣方，顧韻，陳芹，謝軍，張銘，馬永明

（江蘇大學附屬人民醫(yī)院1．耳鼻喉科，2．骨科，3．中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨中線粒體酶表達的變化

錢煒1，Bipin Kumar Rai1，袁即山2，劉嫣方3，顧韻1，陳芹3，謝軍2，張銘3，馬永明1

（江蘇大學附屬人民醫(yī)院1．耳鼻喉科，2．骨科，3．中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討正常軟骨與骨性關節(jié)炎軟骨中線粒體幾種關鍵酶的表達差異。方法：收集9例骨性關節(jié)炎患者及12例正常人的軟骨，HE染色觀察軟骨的病理學表現(xiàn)。利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RQ-PCR）和蛋白質印跡法檢測兩組軟骨中NADH氧化還原酶輔酶1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1，NDUFA1）、琥珀酸脫氫酶復合體鐵硫亞基（succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）、細胞色素b（cytochrome b，Cytb）、細胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）、蘋果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短鏈羥烷基輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表達情況。結果：骨性關節(jié)炎軟骨中滑膜細胞增生，淋巴細胞浸潤，嚴重者甚至出現(xiàn)斑片狀鈣化和纖維化。骨性關節(jié)炎軟骨中NDUFA1與COX表達比正常軟骨明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；SDHB、Cytb、V-ATPase H表達比正常軟骨明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；MDH與HADHSC在兩組中表達無明顯差異。結論：線粒體關鍵酶的變化可能在骨性關節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用。

骨性關節(jié)炎；軟骨；線粒體；酶

近年來骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）已逐漸成為威脅健康的疾病。骨性關節(jié)炎具有明顯的年齡相關性，隨年齡增高患病風險明顯增加。臨床癥狀主要包括關節(jié)疼痛、捻發(fā)音、腫脹、僵硬、疲勞及功能受限。病理主要表現(xiàn)為基質的降解和細胞的死亡，從而逐漸破壞關節(jié)軟骨的完整性［1－4］。骨性關節(jié)炎的致病因素至今仍不明確。研究顯示線粒體可能在骨性關節(jié)炎的致病中起到重要的作用［5－6］。盡管如此，線粒體中某些重要酶的含量在骨性關節(jié)炎軟骨中的變化仍不明確。本實驗擬比較骨性關節(jié)炎患者軟骨與正常軟骨線粒體中NADH氧化還原酶輔酶1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1，NDUFA1）、琥珀酸脫氫酶復合體鐵硫亞基（succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）、細胞色素b（cytochrome b，Cytb）、細胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）、蘋果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短鏈羥烷基輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表達差異，探尋線粒體在骨性關節(jié)炎致病中的意義。

1 對象和方法

1．1 研究對象

收集2013年6月至2014年2月共9例骨性關節(jié)炎患者及12例正常人的軟骨。骨性關節(jié)炎軟骨來自已確診為骨性關節(jié)炎的患者（女6例，男3例，年齡55～74歲，中位69歲）進行關節(jié)置換術時切除的軟骨。正常軟骨來自車禍截肢或急性關節(jié)外傷關節(jié)軟骨碎片脫落無法重新固定的患者（女8例，男4例，年齡42～82歲，中位66歲）。所有標本來自于江蘇大學附屬人民醫(yī)院。本研究方案獲本院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1．2 材料

兔抗人NDUFA1、SDHB抗體，HE染色試劑盒購買于武漢博士德生物工程有限公司。兔抗人COX抗體購買于Cell Signaling生物技術公司。兔抗人Cytb、V-ATPase H抗體，鼠抗人MDH、HADHSC、β-肌動蛋白抗體購買于Santa Cruz生物技術公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購買于碧云天生物技術研究所。

1．3 組織固定和HE染色

新鮮軟骨用4%甲醛固定，石蠟包埋。蠟塊切成4μm切片，37℃烘箱加熱3 h，二甲苯脫蠟，蘇木精和伊紅染色。顯微鏡下進行病理觀察。

1．4 RNA提取和逆轉錄反應

軟骨切成小塊之后加液氮研磨，加入TRIzol裂解。將2．0μg總RNA應用隨機引物逆轉錄合成第一鏈cDNA，總體系40μL，含MMLV逆轉錄酶200U、dNTP（每種0．5 mmol／L）10 mmol／L、隨機引物10μmol／L、RNA酶抑制劑80 U，37℃逆轉錄1 h，95℃5 min滅活，cDNA保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1．5 RQ-PCR檢測軟骨線粒體酶mRNA的表達

25μL PCR反應體系包括10×PCR緩沖液、4 mmol／L MgCl2、0．2 mmol／L dNTP、引物0．4 mmol／L、20×EvaGreen（Hayward公司，美國）1．2μL、50× ROX 0．5μL、Taq DNA聚合酶（Fermentas）1 U及cDNA 2μL。反應在ABI 7300擴增儀上進行，以ABL作為內參照，2－ΔΔCT法計算目的基因表達的相對含量。引物序列見表1。

1．6 免疫印跡檢測7種線粒體酶的表達

新鮮軟骨立即凍存在－80℃直至使用。軟骨切成小塊之后加液氮研磨，加入RIPA裂解。軟骨裂解液用BCA法測定蛋白濃度，調整蛋白量一致后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后轉移至PVDF膜。5%BSA室溫封閉1h，加入相應的一抗（NDU-FA1 1∶100，SDHB 1∶100，Cytb 1∶200，COX 1∶1 000，V-ATPase H 1∶200，MDH 1∶200，HADHSC 1∶200，β-肌動蛋白1∶5 000）4℃過夜。TBST洗膜之后加入HRP標記的相應二抗，ECL顯色液化學發(fā)光檢測。條帶用LAND-1D進行灰度掃描。

1．7 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗至少重復3次，結果用±s表示。兩組間比較采用t檢驗，取95%可信區(qū)間。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 骨性關節(jié)炎患者軟骨的病理學變化

HE染色排除正常對照組中存在含有疾病的軟骨。與正常軟骨相比，骨性關節(jié)炎軟骨中軟骨細胞減少、滑膜細胞增生、淋巴細胞浸潤，嚴重者甚至出現(xiàn)斑片狀鈣化和纖維化，見圖1。

2．2 軟骨中線粒體酶mRNA的變化

RQ-PCR檢測兩組軟骨中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的mRNA表達。結果顯示，骨性關節(jié)炎軟骨中NDUFA1及COX表達比正常軟骨明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；SDHB、Cytb及V-ATPase H表達比正常軟骨明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；MDH、HADHSC在兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

2．3 蛋白質印跡檢測軟骨中線粒體酶的變化

為了驗證RQ-PCR的結果，我們用蛋白質印跡進一步檢測軟骨中這7種酶的蛋白表達情況。結果顯示，與正常軟骨相比，NDUFA1、COX在骨性關節(jié)炎軟骨中明顯升高（P＜0．05或P＜0．01）；SDHB、Cytb、V-ATPase H在骨性關節(jié)炎軟骨中明顯下降（P＜0．05）。MDH、HADHSC在兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖3、圖4。

3 討論

骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制尚不十分明確，近年來軟骨細胞線粒體在骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中所起的作用越來越受到重視。一方面線粒體可以通過線粒體途徑介導軟骨細胞的凋亡，另一方面又可以通過本身在細胞能量代謝中的作用介導細胞凋亡和通過影響ATP的平衡來直接誘發(fā)骨性關節(jié)炎的早期病損［7］。線粒體ATP的產生主要依靠內膜上的電子傳遞鏈完成。在線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程中，電子的化學位能被復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ利用，將基質中的質子泵到膜間隙中，從而將能量儲存在線粒體內膜兩側的質子電化學勢梯度中，最后質子通過ATP酶回到基質中，其電化學勢能被用來合成ATP分子［8－10］。呼吸鏈及最后偶聯(lián)生成ATP的過程出現(xiàn)問題會導致線粒體功能障礙，進而影響軟骨細胞的能量代謝，這可能與骨關節(jié)炎的軟骨退變過程相關。

研究證實軟骨細胞線粒體承擔鈣離子的轉運并在細胞外基質的鈣化中起到重要作用。礦物沉積主要在線粒體內的基質囊泡內形成，而且抑制線粒體電子傳遞鏈酶活性可以促進基質囊泡介導的軟骨鈣化［11－13］。我們通過對骨性關節(jié)炎患者軟骨的病理學觀察發(fā)現(xiàn)不少軟骨存在基質鈣化，而且這些軟骨中線粒體關鍵酶發(fā)生了變化，推測這些線粒體關鍵酶數(shù)量的變化可能也與基質鈣化相關，還需要進一步研究證實。

目前對于線粒體呼吸鏈酶復合體活性在骨性關節(jié)炎軟骨中的變化研究較多，但是對于酶含量變化的研究較少。研究顯示，與正常軟骨相比，骨性關節(jié)炎軟骨中的線粒體數(shù)量增多，呼吸鏈復合體Ⅱ和Ⅲ的活性明顯下降，復合體Ⅰ的活性也下降，但是差異無統(tǒng)計學意義。復合體Ⅳ的活性在兩組中無明顯差異［14］。我們通過對兩組軟骨線粒體呼吸鏈關鍵酶表達的比較發(fā)現(xiàn)，骨性關節(jié)炎軟骨中NDUFA1、COX增高，SDHB、Cytb、V-ATPase H下降，與呼吸鏈復合體的活性變化存在相同之處。在這些關鍵酶中COX是線粒體重要的結構蛋白，其含量的多少可以從側面反映線粒體的質量，表達增高可能提示線粒體數(shù)量的增多，估計是一種補償線粒體呼吸鏈功能下降的代償機制。骨性關節(jié)炎軟骨中SDHB、Cytb、V-ATPase H表達下降，推測這些酶表達量下降導致線粒體呼吸鏈酶活性降低，從而導致線粒體功能受損，ATP生成減少，線粒體功能的破壞使得細胞更多地依賴于糖酵解途徑供能，這就讓細胞更多地暴露于自由基的氧化損害之下，并最終被誘導凋亡。文獻報道復合體Ⅱ和Ⅲ功能失調可能通過上調復合體Ⅰ這條低氧耗途徑來補償［15］，這可能是NDUFA1表達增高的原因之一。

基質中MDH是一個重要的涉及糖代謝的NAD＋依賴的酶，為基質標志酶。關于MDH與骨性關節(jié)炎的關系尚未見報道。本研究結果表明，與正常軟骨相比骨性關節(jié)炎軟骨中MDH變化無統(tǒng)計學意義，推測MDH在骨性關節(jié)炎發(fā)病中的作用并不重要。HADHSC也是線粒體的基質酶，參與脂類代謝，對于短鏈脂肪酸和中間產物的氧化至關重要。目前關于軟骨是否能利用脂肪酸進行能量代謝的研究尚未見報道，也許軟骨細胞能夠利用脂肪酸代謝作為能量來源，但這些成分的重要性尚無定論。本研究中骨性關節(jié)炎軟骨中HADHSC與正常軟骨相比無明顯差異，提示HADHSC可能與骨性關節(jié)炎的關系并不密切。

綜上所述，NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H這些電子傳遞鏈酶在骨性關節(jié)炎軟骨中表達出現(xiàn)了明顯的改變，而MDH、HADHSC這兩種線粒體基質酶在骨性關節(jié)炎軟骨中的表達并無明顯變化，推測線粒體電子傳遞鏈關鍵酶的變化可能在骨性關節(jié)炎的發(fā)病中起到重要的作用。進一步研究這些線粒體酶變化的機制，將會更為詳細地揭示線粒體酶與骨性關節(jié)炎發(fā)病之間的關系。

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Expression of certain m itochondrion enzymes in cartilages of osteoarthritis

QIANWei1，Bipin Kumar RAI1，YUAN Ji-shan2，LIU Yan-fang3，GU Yun1，CHEN Qin3，XIE Jun2，ZHANGMing3，MA Yong-ming1
（1．Department of Otolaryngology，2．Departmentof Orthopaedics，3．Departmentof Central Laboratory，the Affiliated People’s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To compare the expressions of seven importantmitochondrion enzymes in osteoarthritis（OA）cartilages and normal cartilages．M ethods：Specimens of human articular cartilage were collected from a total of 9 osteoarthritis patients and 12 normal controls．H＆E staining showed the histologic structure of cartilage．Expressions of NDUFA1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1），succinate dehydrogenase complex（SDHB），cytochrome b（Cytb），COX（cytochrome c oxidase），V-ATPase H（vacuolar-type H＋-ATPase），cytosolic malate dehydrogenase（MDH），hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase（HADHSC）were detected by RQ-PCR and Western-blot．Results：Compared with normal cartilage，synoviocytes proliferation and lymphocytes infiltration could be observed in osteoarthritis group．The expressions of NDUFA1 and COX increased in osteoarthritis cartilages，expressions of SDHB，Cytb，V-ATPase H decreased in osteoarthritis cartilages．The differences were statistically significant（P＜0．05）．There was no statistical significance in MDH and HADHSC expression between the two groups．Conclusion：Changes of some importantmitochondrion enzymesmay play an important role in pathopoiesis of osteoarthritis．

osteoarthritis；cartilage；mitochondrion；enzymes

錢煒（1962—），男，江蘇鎮(zhèn)江人，主任醫(yī)師，博士，主要從事耳鼻咽喉臨床和基礎研究。

R684．3

A

1671－7783（2014）06－0505－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140231

江蘇省“六大人才高峰”高層次人才資助項目（2011-WSN021D）；江蘇省醫(yī)學科研招標立項課題（H201353）；鎮(zhèn)江市科技支撐社會發(fā)展項目（SH2012042）

2014－08－19 ［編輯］何承志