一步法宮頸脫落細胞人乳頭瘤病毒DNA抽提方法的建立

趙琪

（南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫214023）

一步法宮頸脫落細胞人乳頭瘤病毒DNA抽提方法的建立

趙琪

（南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫214023）

目的：建立一步法抽提宮頸脫落細胞人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA的方法。方法：收集200例宮頸脫落細胞標本，分別采用柱式法DNA提取試劑盒和一步法抽提HPV-DNA，用微量核酸測定儀測定DNA的純度和濃度，采用PCR反向斑點雜交（PCR-RDB）法進行HPV-DNA分型檢測。結果：柱式法抽提的DNA純度和濃度分別為（1．91±0．14）μg／mL和（139．78±18．21）μg／mL，一步法抽提的DNA純度和濃度分別為（1．86±0．19）μg／mL和（124．36±17．35）μg／mL，兩種方法的DNA純度和濃度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。柱式法和一步法HPV分型的總陽性率、單一感染率、多重感染率分別為17．5%（35／200）、7．5%（15／200）、10%（20／200）和17．5%（35／200）、8%（16／200）、9．5%（19／200），兩法一致性檢驗Kappa值為0．886，結果具有較好的一致性。結論：一步法提取宮頸脫落細胞HPV-DNA步驟簡單，DNA質量高，完全適用于臨床樣本的HPV分型檢測。

聚合酶鏈反應；反向斑點雜交；人乳頭瘤病毒；DNA提?。灰徊椒?；分離方法

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種嚴格嗜上皮細胞的病毒，HPV感染與宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）有關，高危型別HPV是許多生殖道疾病或生殖道癌癥的致病原因之一［1－2］。HPV分型檢測作為臨床預測患病風險、選擇治療方案和HPV疫苗開發(fā)研究的重要指標，日益受到重視。HPV-DNA提取方法的研究是對其基因型檢測的基礎和前提，提取的DNA質量也直接影響后續(xù)的實驗操作。目前，HPV在臨床上的應用除了受到分型方法繁瑣和成本昂貴等因素限制之外，HPV-DNA提取過程過于復雜也限制臨床上廣泛使用。為了減少工作強度和提高DNA質量，建立一種操作簡單，成本低廉，質量符合PCR擴增需要的HPV-DNA提取方法顯得特別重要。本研究建立了一步法HPV-DNA提取法，并與柱式法DNA提取法相比較，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1．1 標本

收集200例2013年5月至12月來本院體檢的女性宮頸脫落細胞標本，其中正常狀態(tài)標本（不帶血液和黏液、外觀清亮）60例，帶血標本（外觀紅色或紅褐色）40例，帶黏液標本（外觀混濁、膠凍狀）50例，帶血帶黏液標本（外觀紅色或紅褐色、膠凍狀）50例。每份樣本混勻后平均分為2管，每管各吸取500μL宮頸液。根據隨機分配原則，一管標本采用柱式法DNA提取試劑盒抽提HPV-DNA，另外一管則采用一步法進行HPV-DNA抽提。

1．2 主要儀器和試劑

Verriti96孔梯度PCR儀（美國ABI公司），Thermo臺式微量離心機，NV3000C核酸測定儀（美國），Bioer恒溫金屬浴，亞能YN-H16雜交儀，TY-80R脫色搖床。

本研究所用引物和探針由上海英駿生物公司合成。多重PCR試劑盒購自Qiagen公司，柱式法DNA提取試劑盒、TMB購自上海生工生物工程有限公司，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素購自碧云天生物技術有限公司；A、B、C液和一步法HPVDNA提取液為本室自配，PCR反向斑點雜交（PCR reverse dot blot，PCR-RDB）法HPV分型試劑由本室研制。

1．3 方法

1．3．1 DNA提取 ①一步法HPV-DNA提取步驟：在含宮頸脫落細胞的1．5 mL離心管中加入1 mL雙蒸水，劇烈振蕩（3 000 r／min）10 min（正常狀態(tài)標本可省略此步），13 000 r／min離心5 min，棄上清（帶血樣本重復1次）。在細胞沉淀中加入一步法HPV-DNA提取液100μL。充分混勻，100℃煮沸10 min。13 000 r／min離心5 min，上清備用。②柱式法提取HPV-DNA按說明書操作。分別取2μL兩種方法提取的HPV-DNA用微量核酸測定儀測定DNA純度和濃度。

1．3．2 PCR體系及擴增 將上下游引物稀釋至100μmol／L后各取5μL混勻分別配成上下游混合引物。50μL多重PCR擴增體系中包含25μL Qiagen緩沖液，5μLQ-溶液，5μL染料，0．157 5μL的上游引物和0．362 5μL的下游引物，模板4μL，水10．48μL。95℃預變性10min；95℃30 s，50℃90 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；68℃延伸10 min。

1．3．3 雜交 HPV PCR-RDB分型方法簡述如下：取20μL PCR產物加入含8 mL A液的雜交管中，100℃變性10 min。放入雜交儀中51℃雜交2 h。取出膜條，放入預熱至51℃裝有B液的雜交管中，51℃搖洗5 min。取出膜條，放入用 A液1∶2 500稀釋的HRP標記的鏈霉親和素中，室溫輕搖孵育30 min。A液室溫洗滌2次，每次5 min。C液洗滌膜條2 min，避光顯色3 min，蒸餾水終止反應。膜條相應位置出現(xiàn)肉眼可見的藍色斑點判斷為某型別HPV陽性，用β-球蛋白基因作為內控（IC）。

1．4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 21．0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組樣本的DNA純度、濃度進行配對t檢驗，陽性率比較采用χ2檢驗。一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0．75表明兩者一致性好，0．75＞Kappa值≥0．4表明一致性一般，Kappa值＜0．4表明兩者一致性差。

2 結果

2．1 兩種提取方法所得HPV-DNA的濃度

柱式法與一步法抽提的DNA純度和濃度間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），見表1。

2．2 多重PCR擴增結果

取5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，450 bp處出現(xiàn)條帶為陽性，268 bp處出現(xiàn)條帶為β-球蛋白基因（圖1，只顯示部分結果）。

2．3 兩種HPV-DNA提取方法在HPV分型結果中的比較

200例臨床標本HPV分型結果見表2，柱式法和一步法HPV分型的總陽性率、單一感染率、多重感染率分別為17．5%（35／200）、7．5%（15／200）、10%（20／200）和17．5%（35／200）、8%（16／200）、9．5%（19／200），兩種方法在總陽性率、單一感染率和多重感染率方面無明顯差異（χ2值分別為0，0．037和0．028，P值分別為1，0．847和0．866），兩法一致性檢驗Kappa值為0．886（P＜0．01），結果具有良好的一致性。

3 討論

臨床HPV分型主要是基于PCR的分型法，是目前所有HPV-DNA分析技術中最敏感和方便的方法［3－4］。本研究采用的HPV方法是基于PCR的反向斑點雜交法。DNA提取是HPV檢測的基礎，提取純度及濃度將直接影響基于PCR的HPV分型方法的準確性。D′Souza等［5］也指出，盡管是來源于同一組織的HPV標本，前處理方法的不同也會導致HPV分型的差異。HPV病毒主要存在于宮頸上皮細胞，臨床上收集的標本往往混雜有膿性黏液或血液。本研究的目的是建立一種簡單實用的方法，能從不同狀態(tài)的宮頸脫落細胞標本中抽提出高質量的DNA，用于PCR基礎的HPV分型檢測，確保實驗結果的準確可靠。

細胞基因組DNA提取方法有煮沸法、堿裂解法、SDS裂解法和蛋白酶K消化分離法等。煮沸法雖然操作方法簡單，但細胞DNA收率較低，純度不高，同時內源性抑制物不能有效清除，特別是帶血標本。其他方法如堿裂解法、SDS裂解法和蛋白酶K消化分離法最后都需要飽和酚／氯仿的抽提過程，否則提取的DNA中的蛋白、EDTA和SDS等殘留物質以及內源性抑制物都會對PCR產生抑制作用，而飽和酚／氯仿的抽提過程十分煩瑣，大樣本量的臨床應用受到限制。

柱式法采用硅膠膜作為核酸的特異性吸附材料，提取基本原理為飽和酚／氯仿的抽提加上核酸特異性吸附和洗脫。柱式法提取的核酸完整、純度高，提取的產物可直接用于PCR、RT-PCR及基因克隆等分子生物學實驗研究及臨床檢測。但是柱式法提取基因組DNA成本較高，操作雖然有所簡化但還是相當煩瑣，臨床應用仍然受到限制。

標本中的紅細胞可通過血紅素的卟啉環(huán)與Taq酶產生不可逆結合而抑制Taq酶的活性，導致PCR反應受到抑制［6］。而黏液標本中可能含有較多的黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶和多糖等內源性PCR抑制物，這些物質可通過干擾核酸提取過程的細胞裂解或者通過抑制DNA聚合酶活性而干擾PCR反應［7］。因此本研究共收集200例各種成分的宮頸脫落細胞樣本，包括正常狀態(tài)標本、帶血標本、帶黏液標本和帶血帶黏液標本，觀察一步法提取的DNA是否可以應用于HPV分型。結果表明，本文建立的一步法在DNA提取純度和濃度方面與柱式法雖有明顯差異，但是260 nm／280 nm的比值達到了1．7～1．9的DNA提取要求，濃度足夠滿足進一步實驗需要。PCR結果也證實一步法提取的DNA對擴增無明顯抑制，說明一步法提取的DNA中卟啉環(huán)以及一些內源性PCR抑制物的濃度在不影響PCR結果的安全濃度之內。分析其原因：①通過2次10 min的振蕩棄上清過程，帶血標本中的血紅素卟啉環(huán)濃度大大降低，達到了臨床可接受的使用濃度。②通過10 min振蕩也使黏液標本中的多糖等內源性PCR抑制物大大減少。其他黏蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等蛋白類PCR抑制物則通過一步法提取液中的蛋白沉淀劑得到有效清除。

柱式法和一步法提取DNA后的HPV分型結果一致性檢驗Kappa值達到0．886，顯示相關性良好，并且兩種方法總陽性率的差異無統(tǒng)計學意義。兩種方法的差異僅僅表現(xiàn)在1個標本上，一步法的分型結果顯示是單重感染而柱式法顯示的是雙重感染。這進一步說明，一步法提取的DNA完全適合臨床樣本的HPV分型。

本研究建立的HPV-DNA一步提取法操作簡單方便，全部操作時間：帶血標本約45 min，帶黏液標本約30 min，不帶血液和黏液標本約20 min。這為大批量分析宮頸脫落細胞樣品（特別是黏液型和血液型標本）的HPV分型，提供了一種簡易的DNA提取手段。

總之，本研究建立的一步法提取宮頸細胞HPVDNA，效果類似于柱提法。并且一步法提取DNA有著不可代替的優(yōu)點：①大大減少了DNA提取的工作量，適合大樣本量的HPV分型檢測。②減少污染機會。較柱式法多次抽提換管而言，一步法提取DNA的整個操作在1個Ependorf管中進行，減少了污染的概率。③降低了實驗成本。

［1］ Chinchai T，Chansaenroj J，Swangvaree S，et al．Prevalence of human papillomavirus genotypes in cervical cancer［J］．Int JGynecol Cancer，2012，22（6）：1063－1068．

［2］ Baussano I，Elfstr?m KM，Lazzarato F，et al．Type-specific human papillomavirus biological features：validated model-based estimates［J］．PLoS One，2013，8（11）：e81171．

［3］ Abudukadeer A，Ding Y，Niyazi M，et al．Distribution of HPV genotypes in uterine cervical lesions among the Uighur women in Xinjiang province of China［J］．Eur J Gynaecol Oncol，2010，31（3）：315－318．

［4］ Szostek S，Klimek M，Zawilinska B，et al．Genotypespecific human papillomavirus detection in cervical smears［J］．Acta Biochim Pol，2008，55（4）：687－692．

［5］ D′souza G，Sugar E，Ruby W，et al．Analysis of the effect of DNA purification on detection of human papillomavirus in oral rinse samples by PCR［J］．JClin Microbiol，2005，43（11）：5526－5535．

［6］ Higuchi R．PCR technology：principles and applications for DNA ampliofieation［M］．New York：Stockton Press，1989：31－38．

［7］ 李金明．實時熒光PCR技術［M］．北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：70－71．

Establishment of the one-step DNA extraction method of human papillomavirus in cervical epithelium sam ples

ZHAO Qi
（Department of Clinical Laboratory，Wuxi People′s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi Jiangsu 214023，China）

Objective：To develop an one-step method on DNA extraction of human papillomavirus in cervical epithelium samples．M ethods：The extraction of HPV-DNA in 200 cases collected from cervical epithelium sampleswas treated by column method of DNA extraction kit or one-step method．DNA purity and concentration of the samples were measured by the trace nucleic acid spectrophotometer．HPV genotypeswere detected by PCR reverse dot blot（PCR-RDB）method．Results：DNA purity extracted by column method and one-step were（1．91±0．14）μg／mL and（1．86±0．19）μg／mL，respectively，and concentration of the HPV-DNA were（139．78±18．21）μg／mL and（124．36±17．35）μg／mL，respectively．DNA purity and concentration extracted by twomethodswere all not statistically significant（P＜0．01）．The rates of positive，single infection andmultiple infection of HPV genotyping treated by the columnmethod and one-step method were 17．5%（35／200），7．5%（15／200），10%（20／200）and 17．5%（35／200），8%（16／200），9．5%（19／200），respectively．The value of Kappa was0．886，which indicated that there was a high degree of consistency．Conclusion：The one-step method on HPV DNA extraction was simpler，the DNA quality was high and suitable for HPV DNA genotyping of the cervical epithelium samples．

polymerase chain reaction；reverse dot blot；human papillomavirus；DNA extraction；onestep method；separation method

Q781

A

1671－7783（2014）06－0491－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140261

趙琪（1971—），女，江蘇無錫人，副主任技師，主要從事臨床檢驗診斷學研究。

2014－10－08 ［編輯］何承志