膽固醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成及細(xì)胞凋亡的影響

陸喆，束波，吳柳松，錢民章

（遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563003）

膽固醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成及細(xì)胞凋亡的影響

陸喆，束波，吳柳松，錢民章

（遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563003）

目的：探討膽固醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）活性氧生成及細(xì)胞凋亡的影響。方法：分別用12．5，25，50，100mg／L的膽固醇與HUVECs作用24 h，用50mg／L膽固醇與HUVECs分別作用6，12，24，48 h，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成量。分別用12．5，25，50，100 mg／L的膽固醇以及50 mg／L膽固醇＋N-乙酰半胱氨酸（NAC）與HUVECs孵育24 h，MTT法測定細(xì)胞活力，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：12．5，25，50，100 mg／L膽固醇作用HUVECs 24 h后，均可誘導(dǎo)HUVECs中ROS升高，與對照組（不加膽固醇）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；50mg／L范圍內(nèi)組間差異明顯（P＜0．01），呈劑量依賴性。50mg／L膽固醇作用HUVECs6，12，24，48 h后細(xì)胞內(nèi)ROS生成量均明顯高于對照組（P＜0．01）；24 h內(nèi)組間差異明顯（P＜0．01），呈時間依賴性。MTT結(jié)果顯示，12．5，25，50，100 mg／L膽固醇作用HUVECs24 h后均能降低細(xì)胞的存活率，加入抗氧化劑NAC后，細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0．01）。凋亡率分析結(jié)果表明，50，100 mg／L膽固醇作用HUVECs 24 h后，凋亡率比對照組明顯上升（P＜0．01），加入抗氧化劑NAC后凋亡率明顯下降（P＜0．01）。結(jié)論：膽固醇可通過誘導(dǎo)HUVECs中ROS的升高，促進(jìn)HUVECs的凋亡。

膽固醇；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；活性氧；細(xì)胞凋亡

膽固醇是生物體內(nèi)一種重要的類脂，在血中以脂蛋白的形式運輸。當(dāng)體內(nèi)脂類代謝異常時，膽固醇進(jìn)入細(xì)胞過多或者逆向轉(zhuǎn)運障礙，細(xì)胞對膽固醇攝取與排除的平衡被打破，血管細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間就有可能出現(xiàn)膽固醇的蓄積。這一現(xiàn)象無論在人體自然發(fā)生，還是實驗動物用高飽和脂肪和高膽固醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）中均得到證實［1］。了解這些蓄積在血管細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇對血管的結(jié)構(gòu)與功能造成的影響，對認(rèn)識膽固醇致動脈粥樣硬化的機制很有必要。

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）是構(gòu)成血管內(nèi)皮層的基本單位，是參與動脈粥樣硬化形成的主要細(xì)胞之一。VEC增殖與凋亡的平衡與否關(guān)系到血管內(nèi)皮的完整性和內(nèi)皮多種功能的發(fā)揮。有研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊表面的內(nèi)皮細(xì)胞更新的頻率極快，提示高頻率的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡啟動了動脈粥樣硬化病變［2］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是導(dǎo)致VEC凋亡的重要因素之一［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，50 mg／L膽固醇作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高［4］，且這些ROS主要來源于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）［5］，但HUVECs中ROS的生成量與膽固醇作用的時間及劑量之間的關(guān)系以及生成的ROS是否會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡尚不清楚，本研究對此進(jìn)行了觀察。

1 材料與方法

1．1 材料

HUVECs細(xì)胞株（中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫），膽固醇（Sigma公司），1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，USA），2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA，Sigma公司），噻唑藍(lán)（MTT）、AnnexinV／PI聯(lián)染試劑盒（南京凱基生物科技公司）。

1．2 主要儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（BeckMan公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞儀（BeckMan公司）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

1．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs中ROS的生成

以1×106個細(xì)胞／孔接種HUVECs于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，同步化24 h。分別用12．5，25，50，100 mg／L的膽固醇與HUVECs孵育24 h，以不加入膽固醇的HUVECs為對照組；用50 mg／L膽固醇與HUVECs分別孵育0，6，12，24，48 h。以DCFH-DA為熒光探針，流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS的生成量。

1．4 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率

以1×104個細(xì)胞／孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，同步化24 h，邊緣孔用無菌PBS填充。分別用12．5，25，50，100 mg／L的膽固醇以及50 mg／L膽固醇＋N-乙酰半胱氨酸（NAC）與HUVECs孵育24 h；之后每孔加入20μLMTT溶液（5 mg／mL，即0．5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的光密度（D）值。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。存活率＝（實驗組D值－調(diào)零D值）／（對照D值－調(diào)零D值）×100%

1．5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

分別用12．5，25，50，100 mg／L的膽固醇以及50 mg／L膽固醇＋NAC與HUVECs孵育24 h，離心收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／mL，吸取各組490μL細(xì)胞懸液，分別加入5μL AnnexinV和5 μL PI，4℃避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀分析每組10 000個細(xì)胞，獲得凋亡率。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 HUVECs內(nèi)ROS的生成量

2．1．1 劑量效應(yīng) 12．5mg／L的膽固醇與HUVECs作用24 h即可誘導(dǎo)HUVECs中ROS明顯升高，隨著膽固醇質(zhì)量濃度增大，ROS生成量逐漸增加；各劑量組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；各劑量組間除50 mg／L和100 mg／L膽固醇組ROS生成量差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。見圖1。

2．1．2 時間效應(yīng) 50 mg／L膽固醇作用HUVECs 6 h后細(xì)胞內(nèi)ROS生成量即明顯高于對照組，隨作用時間延長（不超過24 h），ROS生成量逐漸增加，各時間組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；各時間組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0．01），作用24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升明顯，作用48 h比作用24 h細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低（P＜0．01）。見圖2。

2．2 MTT法測定細(xì)胞存活率

MTT結(jié)果顯示，實驗所設(shè)置的4個質(zhì)量濃度膽固醇均能降低HUVECs的存活率，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。50 mg／L膽固醇加入抗氧化劑NAC后，相比50 mg／L膽固醇作用組細(xì)胞存活率明顯上升（P＜0．01）。見圖3。

2．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，各劑量組膽固醇作用HUVECs后，與對照組相比凋亡率明顯上升（P＜0．01）；50 mg／L膽固醇加抗氧化劑NAC組比50 mg／L膽固醇組凋亡率明顯下降（P＜0．01）。見圖4、圖5。

3 討論

本實驗觀察了膽固醇對內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的劑量以及時間效應(yīng)，結(jié)果表明12．5，25，50，100 mg／L的膽固醇在作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量隨著膽固醇質(zhì)量濃度的增大而升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在50 mg／L范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。用50 mg／L膽固醇分別作用細(xì)胞6，12，24， 48 h，細(xì)胞中ROS的生成量與對照組比較明顯增加，在24 h內(nèi)呈現(xiàn)時間依賴性；作用24 h ROS生成量達(dá)到最高峰。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了膽固醇在體外可誘導(dǎo)HUVECs中ROS生成，并且在一定的范圍內(nèi)有劑量和時間依賴性。實驗中發(fā)現(xiàn)膽固醇質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg／L時，ROS的升高和50mg／L相比差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，且50 mg／L膽固醇作用48 h組ROS生成量比24 h組明顯減少，原因尚待研究。

既往研究表明，許多內(nèi)源性或外源性危險因子如高血糖［7］、高血壓及機械應(yīng)激［8－9］都通過誘導(dǎo)心血管細(xì)胞和免疫細(xì)胞中NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂質(zhì)氧合酶產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起ROS生成增多［10］。當(dāng)調(diào)節(jié)ROS的抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化酶被耗盡時，引起線粒體功能障礙，通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖體受體γ共激活因子1（peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator，PGC-1）激活線粒體DNA損傷途徑，致氧化呼吸鏈功能缺陷，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［11］。

為了解膽固醇誘導(dǎo)HUVECs中ROS水平升高對HUVECs生存的影響，本研究采用MTT比色法檢測膽固醇作用后細(xì)胞的存活率。我們選擇了12．5，25，50，100 mg／L的膽固醇作用細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，4種質(zhì)量濃度的膽固醇作用HUVECs 24 h之后，與對照組相比細(xì)胞存活率均顯著下降；加入抗氧化劑NAC后，細(xì)胞存活率明顯升高。這些數(shù)據(jù)說明膽固醇誘導(dǎo)生成的ROS明顯降低了細(xì)胞的存活率。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，4種質(zhì)量濃度膽固醇作用HUVECs 24 h后，與對照組相比細(xì)胞凋亡率均升高；在50 mg／L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性，加入抗氧化劑NAC組較膽固醇單獨作用組凋亡率低，說明膽固醇能通過誘導(dǎo)ROS升高，促進(jìn)HUVECs的凋亡。

綜上所述，膽固醇通過誘導(dǎo)HUVECs中ROS的升高，促進(jìn)HUVECs的凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是動脈粥樣硬化形成的獨立危險因素［11］。本研究結(jié)果為認(rèn)識高脂血癥致動脈粥樣硬化的機制提供了新的實驗資料。

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Effect of cholesterol on ROS generation and cell apoptosis in human umbilical vein endothelial cells

LU Zhe，SHU Bo，WU Liu-song，QIAN Min-zhang
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，ZunyiMedical College，Zunyi Guizhou 563003，China）

Objective：To explore the effect of cholesterol on reactive oxygen species（ROS）generation and cell apoptosis in human vascular endothelial cells．M ethods：HUVECswere treated with different cholesterol concentrations（12．5，25，50，100 mg／L）for24 hours and were stimulated with 50 mg／L cholesterol at different times（0，6，12，24，48 h）．Flow cytometry detected ROS generation．HUVECswere treated with different cholesterol concentrations and Nac．HUVECs survival rate were examined by MTT colorimetric assay and apoptosis rate were examined by flow cytometry．Results：The results showed that the level of ROS will all be elevated when HUVECswere treated with 12．5，25，50，100 mg／L cholesterol for 24 h respectively．Compared with the control group，there was a significant difference（P＜0．01）．It had a significant difference between each groups（P＜0．01）in the range of 50 mg／L，and appeared dose-dependentmanners．HUVECswere processed by 50 mg／L cholesterol for 6，12，24 and 48 hours，the level of ROSgeneration were significantly higher than control group（P＜0．01）；within 24 h emerge significant difference between each groups（P＜0．01），and appeared the time-dependentmanners．The results of MTT showed that 12．5，25，50，100 mg／L cholesterol could reduce the cell survival rate，and adding NAC could enhance survival rate．After HUVECswere processed by 50 mg／L or 100 mg／L cholesterol for 24 h，apoptosis rate was higher than control group（P＜0．01），and the apoptosis rate were decline by adding antioxidants NAC．Conclusion：Cholesterol can enhance the level of ROS in HUVECs，and increase the HUVECs apoptosis．

cholesterol；human vascular endothelial cells；reactive oxygen species；apoptosis

陸喆（1989—），男，碩士研究生；錢民章（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：qian＿mzh＠hotmail．com

R543．5

A

1671－7783（2014）06－0466－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140240

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目（黔科合J字［2009］2178號）

2014－09－15 ［編輯］ 何承志