力竭運動及鈍挫傷對大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞及相關調(diào)節(jié)因子的影響

潘同斌 左偉 夏素文 張樂 朱超 焦寒凝

揚州大學體育學院（江蘇揚州225009）

肌衛(wèi)星細胞在未受到刺激源刺激時處于靜息狀態(tài)， 肌肉蛋白不被表達， 表現(xiàn)出胚胎細胞的一些特點，胞質(zhì)含量很少。當肌肉發(fā)生損傷，包括鈍挫傷時，肌衛(wèi)星細胞處于激活狀態(tài)，產(chǎn)生肌肉調(diào)節(jié)因子，最后通過增殖和分化作用融合成肌管， 通過合成對肌肉再生有重要作用的蛋白質(zhì)參與骨骼肌的修復， 彌補損失的蛋白質(zhì)，最終融合為肌纖維[1，2]。本研究初步摸索力竭運動和鈍挫傷兩種不同處理后的大鼠骨骼肌體外培養(yǎng)成肌細胞的條件及結果， 為進一步探索相關調(diào)節(jié)因子及其機制打下基礎。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一種抑制生長因子，它對肌衛(wèi)星細胞的生長增殖具有抑制作用， 但它對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，對腫瘤疾病、血管生成、纖維化疾病等都起著重要作用，在骨骼肌損傷修復中也起著重要的作用[3，4]。血小板衍生生長因子（PDGF）是一個分子量約30 kD 的堿性糖蛋白，在胚胎發(fā)育、細胞分化和對組織損傷的反應等過程中具有極為重要的作用。 它是創(chuàng)面愈合過程中較早出現(xiàn)的生長因子之一[5，6]。目前，關于血小板衍生生長因子（PDGF）及TGF-β與運動損傷修復關系的研究較少，本研究通過力竭運動損傷模型，探索其在力竭運動后不同時期的變化情況。

1 材料和方法

1.1 動物分組與取材

力竭運動組： 選用7周齡清潔級Wistar雄性大鼠24只， 由揚州大學比較醫(yī)學中心提供， 許可證號：SCXK（蘇）2007-0001。 隨機分為3組，每組6只，進行一次性力竭跑臺運動， 分別于力竭后即刻、24小時、48小時后宰殺（即E0、E24、E48組），并取左側(cè)腓腸肌一分為二，一份立即進行骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)實驗，另一份液氮保存， 用于檢測PDGF和TGF-β， 采用ELISA法。

對照組（C組）：不運動，與E0組同時宰殺。

鈍挫傷組：以Wistar雄性大鼠4只，進行鈍挫傷實驗，在鈍挫傷即刻、24小時后（D0、D24組）分別進行麻醉，每組2只，于受傷處取左側(cè)腓腸肌，立即進行細胞培養(yǎng)實驗。 另取新生鼠（N組）2只，宰殺后取左側(cè)腓腸肌，同樣進行細胞培養(yǎng)實驗。

1.2 力竭運動模型

運動組動物均進行一次性力竭離心運動 （持續(xù)下坡跑）， 依次進行第Ⅰ級負荷 （0°，8.2 m/min）15 min、第Ⅱ級負荷（-5°，15 m/min）15 min、第Ⅲ級負荷（-10°，19.3 m/min）直至力竭。

1.3 鈍挫傷模型

參照Kami等[7]的方法，麻醉后，將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用自制打擊裝置擊打其小腿內(nèi)側(cè)面距跟骨1.5 cm處。 金屬重錘呈漏斗形，底端圓形平面直徑1 cm。 重錘質(zhì)量350 g，打擊時從45.7 cm高度的圓管內(nèi)自由下落，打擊動能為1.57 J，一次性打擊致傷，解剖證實成功率100%。

1.4 細胞培養(yǎng)試劑及儀器

培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品）：高糖DMEM培養(yǎng)基占78%；青/鏈霉素占2%；胎牛血清占10%；標準馬血清占10%。 主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱， 賽默飛世爾（Thermo） 科 技 公 司； 光 學 倒 置 顯 微 鏡， 日 本OLYMPUS公司；NikonE600顯微照相圖像采集系統(tǒng)，日本尼康。

1.5 大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離與培養(yǎng)方法

（1）用眼科剪刀在有少量含2%雙抗的hanks液中將組織剪成1 mm3大小的肉糜， 緩慢將hanks倒掉。（2）倒入少量消化酶（0.25%胰蛋白酶）沉淀至組織沉淀，倒掉液體，留下沉淀。 （3）倒入5 ml左右0.25%胰蛋白酶，振蕩后迅速移至離心管中，放入37℃水浴箱中，消化50～60 min。 （4）依次濾過200目、400目的篩網(wǎng)，濾液收集后用2000 r/min離心10 min，取沉淀加入適量培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。 （5）隔60 min差速貼壁1次，共兩次。將第1次培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液留下繼續(xù)加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。 以后每隔24 h更換培養(yǎng)基，并用倒置顯微鏡進行觀察。

1.6 骨骼肌PDGF和TGF-β測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），北京博奧拓達生物有限公司提供酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。 采用美國ELX800型酶標儀，嚴格按照試劑盒說明操作。 考馬斯亮蘭法進行定氮。

1.7 統(tǒng)計學分析

全部數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003處理，計算平均數(shù)和標準差。統(tǒng)計分析用SPSS 17.0軟件完成，各組間兩兩比較采用方差分析的LSD法， 顯著性差異水平為P < 0.05。

2 結果

2.1 力竭運動及鈍挫傷后不同時期的成年鼠和新生鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞（SC）的體外培養(yǎng)結果

首先，本實驗條件下，對照組（C組）和力竭運動組（E0、E24組）未能觀察到明顯的衛(wèi)星細胞增殖、分化。 但N組新生鼠（N組）1天后即可見到梭形衛(wèi)星細胞，鈍挫傷即刻組（D0組）3天后可見衛(wèi)星細胞梭形分化，而鈍挫傷后24小時組（D24組）5天后可見衛(wèi)星細胞梭形分化，且此3組分化的衛(wèi)星細胞一直保持良好的增殖、傳代，第13天仍長勢良好，可見部分融合和微管。 選取代表性的3組圖片如下：

2.1.1 各組培養(yǎng)1天后及3天后的衛(wèi)星細胞狀況

圖1 D0組培養(yǎng)24小時（×20）

圖2 D0組培養(yǎng)3天后（×20）

圖3 D24組培養(yǎng)24小時（×20）

圖4 D24組培養(yǎng)3天后（×20）

圖5 N組培養(yǎng)24小時（×20）

圖6 N組培養(yǎng)3天后（×20）

圖1、圖3、圖5為各組大鼠腓腸肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)24小時觀察的照片，其中鈍挫傷組D0、D24組未見到激活的肌衛(wèi)星細胞， 但可見含有少許的未被過濾的肌纖維，新生鼠組（N組）可以看見梭形的肌衛(wèi)星細胞。 圖2、圖4、圖6為各組大鼠腓腸肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)3天后的照片，其中鈍挫傷組D24組仍未見到激活的肌衛(wèi)星細胞，鈍挫傷即刻組D0組及新生鼠組（N組）可以看見較多梭形的肌衛(wèi)星細胞。 各組衛(wèi)星細胞的激活時間及增殖數(shù)量存在較大差異。

2.1.2 各組培養(yǎng)5天后及13天后的衛(wèi)星細胞狀況

圖7、圖9、圖11為肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)5天后的照片。此時各組肌衛(wèi)星細胞均呈現(xiàn)梭形， 數(shù)量上較之前幾天均明顯增多，表明肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)第5天開始大量增殖。

圖8、圖10、圖12為肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)第13天照片。各組肌衛(wèi)星細胞分布都非常密集，已密布培養(yǎng)皿中，且出現(xiàn)了融合現(xiàn)象，部分出現(xiàn)微管，說明此時的肌衛(wèi)星細胞已出現(xiàn)分化、融合現(xiàn)象。

圖7 D0組培養(yǎng)第5天（×20）

圖8 D0組培養(yǎng)第13天（×20）

圖9 D24組培養(yǎng)第5天（×20）

圖10 D24組培養(yǎng)第13天（×20）

圖11 N組培養(yǎng)第5天（×20）

圖12 N組培養(yǎng)第13天（×20）

2.2 力竭運動及恢復期間大鼠骨骼肌PDGF及TGF-β的變化情況

PDGF和TGF-β的ELISA結果（表1）顯示，一次力竭離心運動后，與安靜對照組相比較，力竭組大鼠骨骼肌中PDGF均顯著性升高（P < 0.01），而TGF-β均呈現(xiàn)極顯著性降低（P < 0.01）。且力竭各組之間（E0、E24、E48組）無顯著性差異（P > 0.05）。

表1 各組大鼠骨骼肌PDGF及TGF-β的變化

3 討論

3.1 力竭運動、 鈍挫傷和乳鼠的骨骼肌衛(wèi)星細胞（SC）體外培養(yǎng)的增殖和分化情況對比

從骨骼肌中分離獲得的肌衛(wèi)星細胞在體外培養(yǎng)時統(tǒng)稱為成肌細胞。張立貴等[8]觀察了大鼠眼外肌成肌細胞的增殖及分化特征， 采用反復差速貼壁法分離純化成肌細胞，進而進行體外培養(yǎng)、鑒定并觀察其增殖及分化特征，取得了比較滿意的實驗效果。關于其分化性能，Peterson等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肌衛(wèi)星細胞在肥胖大鼠骨骼肌中分化性能降低，但通過運動可恢復、提高其分化能力。 本研究初步摸索及完善了幾種不同處理的大鼠骨骼肌體外培養(yǎng)成肌細胞的條件及結果， 為進一步探索相關調(diào)節(jié)因子及損傷修復機制打下了基礎。

首先，本研究條件下，對照組（C組）和力竭運動組（E0、E24組）取材后，體外培養(yǎng)未能觀察到明顯的衛(wèi)星細胞增殖、分化。 一方面可能由于這3組未能達到損傷激活衛(wèi)星細胞分化的條件， 另一方面可能是操作條件的局限導致未培養(yǎng)成功。 但同樣培養(yǎng)條件下，新生鼠（N組）1天后即可見到梭形衛(wèi)星細胞，鈍挫傷即刻組（D0組）3天后可見衛(wèi)星細胞梭形分化，而鈍挫傷后24小時組（D24組）5天后可見衛(wèi)星細胞梭形分化， 且此3組分化的衛(wèi)星細胞一直保持良好的增殖、傳代，第13天仍長勢良好，可見部分融合成微管。 結果說明新生鼠在發(fā)育的早期， 肌衛(wèi)星細胞即保持著旺盛的分化增殖能力， 早期即具有特異性成肌細胞的活性，且分化、增殖數(shù)量較高。 鈍挫傷對骨骼肌的損傷較重，亦能較強地刺激衛(wèi)星細胞分化，促進其修復，且鈍挫傷即刻組（D0組）啟動較快，3天后可見衛(wèi)星細胞梭形分化，而鈍挫傷后24小時組（D24組）相對啟動較慢，5天后才見衛(wèi)星細胞梭形分化。 且在衛(wèi)星細胞增殖數(shù)量上，D0組高于D24組，這可能與鈍挫傷造成的肌肉中調(diào)節(jié)因子的變化有關， 勢必對體外培養(yǎng)造成較大的影響，其具體機制有待進一步研究。

3.2 力竭運動對大鼠骨骼肌PDGF的影響

PDGF在創(chuàng)傷中起著重要的作用，它刺激有絲分裂，趨化成纖維平滑肌細胞、中性粒細胞、巨噬細胞，并且還刺激巨噬細胞產(chǎn)生創(chuàng)傷愈合各階段中所需的重要細胞生長因子， 還可促進細胞外基質(zhì)分子的產(chǎn)生[5]。 在骨骼肌受到損傷后，受損肌細胞便會發(fā)生炎癥反應，此時巨噬細胞浸潤胞內(nèi)，吞噬壞死細胞同時分泌多種生長因子， 促進骨骼肌的愈合，PDGF就是其中一種。Antoniades等[6]研究發(fā)現(xiàn)PDGF在轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和胰島素樣生長因子（IGF-1）的協(xié)同作用下，在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。

目前， 關于運動影響血小板衍生生長因子的研究還較少，而PDGF可能在骨骼肌損傷和修復過程中發(fā)揮重要作用。 本研究發(fā)現(xiàn)， 在骨骼肌損傷早期，PDGF的濃度便有明顯升高，且差異具有顯著性（P <0.01），由此推測PDGF可能較早參與骨骼肌損傷的修復。 隨著時間的延長，PDGF的濃度也在逐漸升高，48 h時又出現(xiàn)緩慢下降趨勢， 可能是由于炎癥反應下降，釋放的PDGF減少所致。 綜上所述，PDGF可以作為骨骼肌損傷修復的指標之一。

3.3 力竭運動對大鼠骨骼肌TGF-β的影響

于新凱等[3]通過實時熒光定量PCR技術檢測一次力竭離心運動后骨骼肌中不同時期TGF-β1 mRNA表達情況， 發(fā)現(xiàn)在骨骼肌損傷后的6 h、24 h、48 h，TGF-β1 mRNA 表 達 水 平 低 于 對 照 組 （P >0.05），12 h、72 h、1 w和2 w TGF-β1 mRNA表達水平明顯低于對照組（P < 0.05），表明TGF-β1在骨骼肌損傷修復中可能處于抑制狀態(tài)。 這提示TGF-β在骨骼肌損傷修復中可能表現(xiàn)為一種負相調(diào)節(jié)因子，它是通過對細胞周期的調(diào)節(jié)作用從而促進損傷骨骼肌纖維化，抑制肌細胞再生和肌管融合。Kulkarni等[4]通過破壞鼠胚胎干細胞中的TGF-β同族基因建立了TGF-β-null無效突變小鼠模型， 結果表明TGF-β在免疫細胞的增殖和組織分布的自身調(diào)節(jié)中有重要作用。Brown 等[10]在肌萎縮和急慢性肌肉疾病中發(fā)現(xiàn)，組織纖維化的發(fā)生都伴隨TGF-1表達增高， 細胞外基質(zhì)蛋白合成增加，降解減少。

在本實驗模型中， 從骨骼肌中TGF-β的變化情況可以看出，力竭運動E0、E24、E48組與對照組相比較均有極顯著性降低（P < 0.01），但各組在時相上的變化雖有波動，但無顯著性差異。 由此推測，實驗大鼠在一次性離心力竭運動后， 機體受到了一定的損傷，可能導致骨骼肌衛(wèi)星細胞被激活，開始處于增殖期， 此時對肌衛(wèi)星細胞具有正向調(diào)節(jié)作用的生長因子處于高表達狀態(tài)， 而這些正向調(diào)節(jié)因子與TGF-β的拮抗作用導致這一時期的TGF-β處于低水平表達狀態(tài)， 而使TGF-β對骨骼肌衛(wèi)星細胞的抑制作用明顯低于其他正向調(diào)節(jié)因子對骨骼肌衛(wèi)星細胞的促進作用。 關于TGF-β的作用機制還有待進一步研究證實。

4 總結

（1）大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)結果顯示，鈍挫傷刺激對骨骼肌衛(wèi)星細胞有較強的激活作用，且鈍挫傷即刻組比鈍挫傷后24小時組體外增殖、 分化更快，數(shù)量更多。 另外，新生鼠肌肉在未受刺激條件下，其衛(wèi)星細胞即具有較強的增殖、分化能力。

（2） 一次力竭離心運動后， 與安靜對照組相比較， 力竭組大鼠骨骼肌中PDGF均顯著性升高，而TGF-β均呈現(xiàn)顯著性降低， 且力竭各組之間無顯著性差異。這提示PDGF在肌肉損傷修復中可能具有正性作用，而TGF-β則可能起著負性調(diào)節(jié)因子的作用。

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