結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用

地里下提，古甫丁，馬 良

近年來(lái)，結(jié)核的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，除肺部感染外，結(jié)核桿菌還能侵入人體其他各種器官，脊柱結(jié)核是由于結(jié)核桿菌累及脊柱造成的病變，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，誤診極為常見(jiàn)。建立更加快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和診斷脊柱結(jié)核病至關(guān)重要。但臨床常用的結(jié)核菌素皮試試驗(yàn)(tuberculin skin test, TST)對(duì)脊柱結(jié)核的診斷具有敏感度及特異性低、易受患者自身免疫功能水平干擾等缺點(diǎn)[1]，為此本院開(kāi)展了結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn) (T-cell spot of tuberculosis, T-SPOT.TB)試驗(yàn)在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年4月～2013年1月本院骨科收治的疑似脊柱結(jié)核病例156例，其中男82例，女74例；年齡17～81歲，平均25.4歲；所有病例中頸椎9例，胸椎45例，腰椎78例，腰骶椎21例，多節(jié)段3例；病程1～38個(gè)月，平均11.5個(gè)月；患者可伴低熱、盜汗、食欲不振、消瘦、倦怠等全身性中毒癥狀及頸、背、腰部疼痛等局部表現(xiàn)。

1.2 檢測(cè)方法

詳細(xì)詢問(wèn)每個(gè)患者既往結(jié)核病史及結(jié)核病接觸史資料；常規(guī)行胸部X線、脊柱X線、CT和 MRI檢查，合并肺部病變的患者行痰涂片測(cè)試結(jié)核桿菌；所有患者均做T-SPOT.TB試驗(yàn)及TST。

1.2.1 T-SPOT.TB試驗(yàn)檢測(cè)方法

首先采集患者5 mL的外周靜脈血(使用肝素抗凝管)，使用密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞。在已包被抗INF-γ抗體微量板的4孔中，分別加入4種不同的對(duì)照物進(jìn)行對(duì)比：陽(yáng)性對(duì)照物為植物血凝素、陰性對(duì)照物為AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)液、結(jié)核桿菌特異混合多肽A[早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6)抗原]、結(jié)核桿菌特異混合多肽B[培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10, CFP-10)抗原]，然后在上述4孔中每孔中加人含250 000個(gè)細(xì)胞的外周血單個(gè)核細(xì)胞，再將微量板放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h(環(huán)境為37℃，5%CO2)，用PBS洗板4次后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的γ干擾素抗體，PBS洗脫，顯色，PBS終止，最后計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，以測(cè)量孔點(diǎn)數(shù)是陰性對(duì)照的2倍以上或者比陰性對(duì)照多5個(gè)點(diǎn)為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.2 TST(Mantoux法)

選取0.1 mL含5個(gè)單位的結(jié)核桿菌純蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD)對(duì)患者行前臂尺側(cè)皮內(nèi)注射，48～72 h后觀察結(jié)果。硬結(jié)的直徑≥10 mm考慮為T(mén)ST陽(yáng)性。

1.3 脊柱結(jié)核的臨床診斷

脊柱結(jié)核的最終確診需依靠患者的臨床表現(xiàn)、X線、CT和MRI圖像、手術(shù)后組織病理學(xué)及患者對(duì)抗結(jié)核治療的反應(yīng)綜合做出評(píng)估后確定[2]。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

將靈敏性、特異性、假陽(yáng)性率和假陰性率作為2種試驗(yàn)臨床效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床診斷結(jié)果

全部156名疑似脊柱結(jié)核患者中確診112例。其余44例術(shù)后被確診為布氏桿菌性脊柱炎、椎間隙非特異性感染、終板炎、脊柱腫瘤等其他疾病。

2.2 T-SPOT.TB試驗(yàn)與最終診斷結(jié)果比較

T-SPOT.TB試驗(yàn)的靈敏度為85.7% (96/112)，特異度為86.4%(38/44)，假陰性率為14.3% (16/112)，假陽(yáng)性率為13.6%(6/44)。

2.3 TST試驗(yàn)與最終診斷結(jié)果比較

TST試驗(yàn)的靈敏度為33.9% (38/112)，特異度為75.0%(33/44)，假陰性率為66.1% (74/112)，假陽(yáng)性率為25.0%(11/44)。

2.4 2種檢測(cè)方法比較

T-SPOT.TB的靈敏度和特異度數(shù)據(jù)明顯高于TST (P<0．05)；與此同時(shí)其假陰性率和假陽(yáng)性率數(shù)據(jù)低于TST試驗(yàn)(P<0．05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)提示對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有1/3億人口受到結(jié)核分枝桿菌感染，每年約有800萬(wàn)新病例發(fā)生，至少有300萬(wàn)人死于該病。而我國(guó)為結(jié)核病的發(fā)病大國(guó)，每年約新增結(jié)核病患者150萬(wàn)，受感染人數(shù)約5億，且近年來(lái)發(fā)生率又呈上升趨勢(shì)[3]。脊柱結(jié)核又稱Pott病，是椎體感染結(jié)核桿菌后造成的一種破壞性骨關(guān)節(jié)病，其發(fā)生率居全身骨關(guān)節(jié)結(jié)核的首位，占40%～50%。本病好發(fā)于兒童和青年，病變多發(fā)生在椎體，發(fā)病部位成人以腰椎最多，胸椎次之，頸椎、骶椎少見(jiàn)；兒童則以胸椎或胸腰段發(fā)生率最高[4]。病程長(zhǎng)，如不能得到有效治療，嚴(yán)重者可導(dǎo)致骨骼畸形或累及椎管產(chǎn)生脊髓、神經(jīng)壓迫而截癱，嚴(yán)重影響患者健康。因其臨床表現(xiàn)及診斷方法缺乏特異性，極易出現(xiàn)誤診或漏診，如能做到早期診斷、早期治療，則可以有效制止病變發(fā)展，減少畸形發(fā)生，避免手術(shù)治療而采用藥物治愈[5]。因此尋找一種方便、可靠的診斷方法顯得尤為重要。

目前脊柱結(jié)核主要是根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像檢查及病灶局部的病理改變來(lái)確診，且為了取得局部組織進(jìn)行病理檢查對(duì)患者機(jī)體造成一定創(chuàng)傷。細(xì)菌學(xué)檢查或組織學(xué)檢查雖然是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或組織病理學(xué)檢查需時(shí)較長(zhǎng)，檢出陽(yáng)性率低[6]。目前針對(duì)結(jié)核感染的免疫學(xué)檢測(cè)方法主要是檢測(cè)結(jié)核細(xì)胞免疫功能的PPD試驗(yàn)和檢測(cè)體液免疫功能的結(jié)核抗體[7]。PPD試驗(yàn)是體外試驗(yàn)，檢查結(jié)果判定易受檢查者主觀因素影響，且在結(jié)核感染高發(fā)地區(qū)，隨著卡介苗接種的普及，假陽(yáng)性增多，同時(shí)PPD試驗(yàn)結(jié)果也會(huì)受機(jī)體免疫狀態(tài)等多種因素影響，使其在結(jié)核的診斷中靈敏度及特異性均較低。結(jié)核抗體檢測(cè)雖然特異性較高，但缺乏敏感性[8]。

T-SPOT.TB作為近年來(lái)結(jié)核診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，主要用于檢測(cè)外周血標(biāo)本。國(guó)外報(bào)道其靈敏度和特異度分別高達(dá)89．0%和98.1%[9]。機(jī)體被結(jié)核桿菌感染后，體內(nèi)T淋巴細(xì)胞被致敏，當(dāng)這些致敏T細(xì)胞再次受到結(jié)核菌特異性抗原刺激后，繼而產(chǎn)生細(xì)胞因子λ干擾素，通過(guò)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激后釋放λ干擾素的T細(xì)胞數(shù)量，從而診斷結(jié)核分枝桿菌感染；而且無(wú)論是否有臨床癥狀，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在血中的水平可作為機(jī)體是否被感染的指標(biāo)。效應(yīng)T淋巴細(xì)胞存活期很短，一般在病原體被消滅后就消失，故其靈敏度較高。致病性結(jié)核分枝桿菌中一段名為“RD1”的基因序列可以編碼產(chǎn)生結(jié)核桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10，且ESAT-6和CFP-10的編碼基因只存在于致病性分枝桿菌中，而不存在于大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗中，因此T-SPOT.TB的特異度較高，不受大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌感染和卡介苗接種的影響[10]。

綜上所述，T-SPOT.TB試驗(yàn)在脊柱結(jié)核的診斷中具有靈敏度高，特異性高、方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，具有重大的臨床價(jià)值，值得廣泛推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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