磁珠富集法構建播娘蒿SSR文庫及特性分析

王亞平，焦振彬，裴宋雨，葉永忠，王紅衛(wèi)

(1.河南農業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州450002;2.河南農業(yè)大學植物保護學院，河南鄭州450002)

播娘蒿 (Descuminia sophia(L.)Webb.ex Prantl)為十字花科播娘蒿屬1年生或2年生植物，俗名米米蒿，分布于北美洲、亞洲、歐洲及南美洲，在中國主要分布于華北、華東、西北和四川.其種子具有止咳平喘、消腫利尿、抗癌的功效［1］，在調血脂、抗菌等方面也具有顯著的藥理活性［2］.以播娘蒿種子為原料榨出的油可以作為食用油，含有約37%的α-亞麻酸，對人體的健康有重要作用［3］;亦可作為工業(yè)用油，以播娘蒿籽油為原料制備出的脂肪酸甲酯，經(jīng)冷凍處理后表現(xiàn)出和生物柴油相近的性質［4］.播娘蒿種子含油 33% ～44%［5］，無論是作為工業(yè)用油還是食用油，都具有較大的開發(fā)利用價值.因此系統(tǒng)開發(fā)和利用播娘蒿資源，能夠很好的平衡人類對油料的需求.近年來，對播娘蒿的研究多集中在化學成分與生物學特性的分析上［6～9］，關于播娘蒿遺傳資源的研究鮮有報道.研究播娘蒿的遺傳多樣性，對今后播娘蒿野生資源的開發(fā)和利用十分必要.分子標記是研究植物資源的有效手段，其中SSR標記具有共顯性、重復性強、多態(tài)性高、多態(tài)位點豐富等優(yōu)點［10］，它比其它分子標記如RFLP，RAPD，AFLP和ISSR雖然成本高，但能較好的運用于植物分類、群體遺傳多樣性研究和基因圖譜的構建.傳統(tǒng)的SSR文庫構建策略不僅復雜，而且效率低，利用磁珠富集法構建SSR文庫具有操作簡單、效率高等優(yōu)點.它的原理是用含有生物素標記的探針如(CA)10與基因組DNA酶切片段含SSR片段特異性雜交，而磁珠外邊所包被的鏈霉素親和素可以和探針上的生物素共價結合，通過磁珠的磁力直接將探針連同與之互補的含有SSR片段吸附［11］.這種方法能顯著縮短構建SSR文庫的時間，并且極大的提高了效率.本研究即是利用Dynal磁珠富集法構建播娘蒿SSR文庫，研究播娘蒿的遺傳資源，為播娘蒿的資源研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

播娘蒿材料是2012-04-18采自鄭州北郊的黃河濕地國家級自然保護區(qū)，沿直線每隔50 m取樣1次(共20份)，采集的葉片加硅膠密封包裝，干燥處理1周后用于提取DNA.干燥處理過程中，如發(fā)現(xiàn)硅膠變紅，立即更換硅膠.

1.2 方法

1.2.1 酶切 本研究采用Dynal磁珠富集法構建播娘蒿SSR文庫.首先采用改良的CTAB法［12］提取播娘蒿基因組DNA，純化后利用內切酶Rsa I于16℃溫度下酶切16 h.

1.2.2 連接 獲得的酶切產物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后加上接頭SuperSNX 24-F(5’-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC)和 SuperSNX24-R(5’-pGATTCTGCAGCTAGGCCTTAAAC AAAA).對加接頭產物進行 PCR擴增，反應體系25 μL，為10×PCR 緩沖液 2.5 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 1.3 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.875 μL，雙蒸水 18.3 μL，5 U·μL-1exTaq 0.2 μL，加接頭的 DNA 2 μL.PCR程序為95℃預變性2 min，隨后為95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸90 s的24次循環(huán)，最后15℃保持10 min.PCR反應后進行瓊脂糖凝膠檢測，檢測成功后進行富集工作.

1.2.3 富集 利用含有生物素標記的(AC)8，(AG)8和(ATG)12(由上海生工合成)探針與連接產物充分雜交，雜交后利用Dynal磁珠對雜交產物進行富集.采用PCR對富集DNA片段進行擴增，反應體系為 25 μL，10 × PCR 緩沖液 2.5 μL，1 000 mg·μL BSA 0.625 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 1.3 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.875 μL，雙蒸水 16.5 μL，5 U·μL-1exTaq 0.2 μL，富集 DNA 片段 2 μL.PCR程序為95℃預變性2 min，隨后為95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸90 s的24次循環(huán)，72℃充分延伸30 min后于15℃保持10 min.PCR反應后進行瓊脂糖凝膠檢測.

1.2.4 克隆及克隆篩選 將富集產物連接到pMD18-T上，轉入DH 5α感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基上進行克隆培養(yǎng)，挑選陽性克隆轉入液體LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng).利用SuperSNX 24-F引物對菌液克隆進行PCR檢測，反應體系10 μL，包括2×PCR Taq Mix 5 μL，雙蒸水 4 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 0.5 μL，菌液 0.5 μL.反應程序為94℃預變性10 min，隨后進入30次循環(huán)，包括94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后終延伸10 min，15℃保持10 min.選擇插入片段長度為400～1 000 bp的克隆.

隨后，采用 M13F，M13R 和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探針相結合的方法對文庫進行2次PCR擴增篩選，PCR 體系10.5 μL，包括2 ×PCR Taq Mix 5 μL ，雙蒸水 3 μL，10 μmol·L-1M13R(F)0.5 μL，10 μmol·L-1(AC)80.5μL，10 μmol·L-1(AG)80.5 μL，10 μmol·L-1(ATG)50.5 μL.反應程序為94℃充分變性10 min，隨后進入30次循環(huán)，包括94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后終延伸10 min，15℃保持10 min.對擴增出條帶的克隆送樣測序(此工作由華大基因完成).

1.3 數(shù)據(jù)處理

WEBER將SSR分為3種類型［13］，完全型為核心序列以不間斷的重復方式構成SSR;不完全型是核心序列之間有幾個非重復堿基，但其兩端的核心序列重復次數(shù)大于3;混合型為2種或2種以上的串聯(lián)核心序列由幾個連續(xù)的非重復堿基分隔開，但各種連續(xù)性的核心序列重復次數(shù)不少于5.測序后，統(tǒng)計SSR情況，柳屬植物研究中，表現(xiàn)出多態(tài)性的二核苷酸基元重復次數(shù)在4次以上［14］，本研究統(tǒng)計二核苷酸基元重復次數(shù)在4次以上的;三核苷酸及其以上基元統(tǒng)計重復次數(shù)在3次以上［15］，計算完全型SSR，不完全型SSR以及混合型SSR各自所占的比例，以及平均單個克隆含有的SSR位點數(shù)等.

2 結果與分析

2.1 酶切結果

對純化后的播娘蒿總基因組DNA利用內切酶Rsa I進行酶切，酶切產物集中在300～1 000 bp(圖1)，符合后續(xù)試驗對DNA片段長度的要求.

圖1 播娘蒿基因組DNA Rsa I酶切產物Fig.1 The result of enzyme digestion of Descuminia sophia genomic DNA with RsaⅠ

2.2 連接結果

以SuperSNX24-F作為引物對連接產物進行PCR擴增，取2 μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2).連接結果很成功，可以直接用于下一步富集.

2.3 富集

生物素標記的探針與加接頭的DNA片段雜交，磁珠吸附后對富集片段進行PCR擴增，為增加富集產物濃度，做3管PCR，富集結果如圖3，富集片段集中于500～800 bp，適用于構建SSR文庫.

圖2 連接產物檢測結果Fig.2 PCR products of ligated DNA

圖3 富集產物PCR結果Fig.3 PCR products of microsatellite-enriched DNA

2.4 克隆篩選

將3管PCR合并純化，與PMD18-T載體連接后轉入感受態(tài)細胞在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共挑選774個陽性克隆至液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)后進行菌液PCR擴增檢測，檢測結果如圖4.為避免盲目測序，對有條帶的菌液用 M13R(F)通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探針相結合進行 2 次篩選，選取含有理想條帶的克隆進行測序.

2.5 播娘蒿SSR統(tǒng)計

篩選獲得93條插入片段為400～1 000 bp的克隆測序.經(jīng)測序，82條序列含有SSR位點，占測序總條數(shù)的88.17%.共有SSR位點數(shù)127個，完全型SSR位點數(shù)目102個，不完全型SSR位點數(shù)目10個，混合型SSR位點15個.SSR重復單元(表1)中，以二核苷酸(TC/CT)，(AC/CA)，(TG/GT)和三核苷酸(TGA/GAT/ATG)最為常見，得率分別為 20.47%，26.77%，21.26%和 15.75%.

圖4 菌液PCR檢測結果Fig.4 PCR amplification of clones

表1 播娘蒿微衛(wèi)星富集文庫基元類型及比例Table 1 Characteristics of the enriched library of Descuminia sophia in terms of the identified microsatellite sequences

本研究采用磁珠富集法構建播娘蒿SSR文庫，該方法中探針與不含SSR位點的片段存在一定程度的結合，為減少測序的盲目性，使用M13R載體通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探針相結合進行2次篩選，共測序93條，含有SSR位點的序列就有82條，占測序總條數(shù)的88.17%.

播娘蒿SSR文庫中出現(xiàn)了16種重復基元，以二核苷酸 AC/CA，TG/GT，TC/CT和三核苷酸TGA/GAT/ATG出現(xiàn)次數(shù)最多，分別為34，27，26和20次，占 SSR位點總數(shù)的20.47%，26.77%，21.26%和15.75%，其它重復基元出現(xiàn)次數(shù)較少.本研究使用的生物素探針為(AC)8，(AG)8和(ATG)12，研究結果中SSR基元多以與這些探針互補配對為主.如果增加更多類型的探針，估計會得到更多類型的SSR基元.文庫中，二核苷酸基元最多重復35次，三核苷酸單元最多重復26次，四核苷酸基元最多重復4次，六核苷酸基元最多重復4次.

播娘蒿SSR位點中，重復次數(shù)在4～35次(表2)，重復次數(shù)在4～10次的有80個，占SSR位點總數(shù)的62.99%;重復次數(shù)在11～20次的有31個，占SSR位點總數(shù)的24.41%;重復次數(shù)在20次以上的有16個，占SSR位點總數(shù)的12.60%.

表2 SSR重復次數(shù)分布Table 2 SSR repetition number distribution

播娘蒿SSR位點中，重復長度在8～95 bp(表3)，重復長度在8～20 bp的有65個，占SSR位點數(shù)的51.18%;重復長度在20～40 bp的有40個，占SSR位點數(shù)的31.50%;重復長度大于40 bp的有22個，占SSR位點數(shù)的17.32%.

表3 SSR重復長度分布Table 3 SSR repeatitiion length distribution

3 討論

播娘蒿SSR重復基元以二核苷酸重復基元最多，占SSR位點總數(shù)的69%.在蓮屬植物的研究中，設計的11對SSR引物全部來自于二核苷酸重復的基因序列［16］;谷子的研究中，分析多態(tài)性的22對引物中有20對引物的SSR為二核苷酸重復［17］;用于分析銀杏遺傳多樣性的11對引物其SSR全部為二核苷酸重復［18］.這說明用二核苷酸重復基元的DNA片段設計引物，較容易檢測多態(tài)性.本研究獲得的播娘蒿SSR文庫中，二核苷酸重復的位點占69.68%，滿足開發(fā)SSR標記的需要.

杜仲20個能檢測到多態(tài)性的SSR分子標記中，其二核苷酸SSR重復次數(shù)在9～16次，三核苷酸SSR重復次數(shù)在7～12次［19］;蘭屬植物遺傳多樣性研究中，表現(xiàn)出多態(tài)性的14對SSR引物中，二核苷酸SSR重復次數(shù)在9～32次，三核苷酸SSR重復次數(shù)在4～12次［20］;中國紅棗的研究中，表現(xiàn)出多態(tài)性的25對SSR引物，全部為二核苷酸基元重復，重復次數(shù)在6～15次［21］.而播娘蒿的二核苷酸基元重復次數(shù)分布在4～35之間，三核苷酸基元重復次數(shù)分布在4～26，大部分克隆含有潛在多態(tài)SSR位點，可進行下一步開發(fā) SSR位點引物的工作.

［1］ 錢利武，張小平，蔣繼宏.播娘蒿研究進展［J］.中國野生植物資源，2006，25(3):8-10.

［2］ 李紅偉，鄭曉珂，弓建紅，等.獨行菜和播娘蒿化學成分及藥理作用研究進展［J］.藥物評價研究，2013，36(3):235-240

［3］ 羅 晴，柏正強，張兆清，等.川西草原植物資源播娘蒿亞麻酸含量的研究［J］.四川草原，2003(1):45-46.

［4］ 張建強.從播娘蒿籽油中富集α-亞麻酸及其制備生物柴油的研究［D］.蘭州:蘭州大學，2007.

［5］ 李孟良.沿淮地區(qū)播娘蒿種子油脂肪酸成分研究［J］.安徽科技學院學報，2013，27(1):21-24.

［6］ 王新芳，董 巖，劉洪玲.播娘蒿揮發(fā)油化學成分的GCMS研究［J］.山東中醫(yī)雜志，2005，24(2):112-114.

［7］ 孫 凱，李 銑.南葶藶子的化學成分［J］.沈陽藥科大學學報，2003，20(6):419-421.

［8］ 李孟良，楊安中，牟筱玲，等.播娘蒿角果生長特性的研究［J］.中國油料作物學報，2004，26(2):95-97.

［9］ 代旭蘭，黃 敏，易秀麗，等.播娘蒿抗寒性生理研究［J］.四川大學學報:自然科學版，2007，44(1):199-202.

［10］ 王凱華，張文英，王 會，等.國內外甘藍型油菜種質SSR標記遺傳多樣性分析［J］.中國農學通報，2011，27(19):144-149.

［11］ 彭鎮(zhèn)華，劉貫水，李潞濱.磁珠富集法開發(fā)毛竹SSR標記引物［J］.林業(yè)科學研究，2011，24(6):743-748.

［12］ WANG H W，ZHANG B，WANG Z S，et al.Development and characterization of microsatellite loci in Taihangia rupestris(Rosaceaea)，a rarecliff herb［J］.Amerian Journal of Botany，2010，97(12):136-138.

［13］ WEBER J L.Informativeness of human(dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms ［J］.Genomics，1990，7(4):524-529.

［14］ 鄧玉營，黃花柳.微衛(wèi)星富集文庫構建及標記篩選［D］.南京:南京林業(yè)大學，2005

［15］ 程月琴，王紅衛(wèi)，萬慧霞，等.文冠果富集SSR文庫的構建及特性分析［J］.河南農業(yè)大學學報，2013，47(4):440-445.

［16］ KUBO N，HIRAI M，KANEKO A，et al.Development and characterization of simple sequence repeat(SSR)markers in the water lotus(Nelumbo nucifera)［J］.A-quatic Botany，2009，90(2):191-194.

［17］ 李 琳.富集文庫法開發(fā)谷子的微衛(wèi)星分子標記［D］.石家莊:河北師范大學，2008.

［18］ 陳燁燁.銀杏微衛(wèi)星文庫的構建和遺傳多樣性分析［D］.杭州:浙江大學，2008.

［19］ 黃海燕，杜紅巖，烏云塔娜，等.基于杜仲轉錄組序列的SSR分子標記的開發(fā)［J］.林業(yè)科學，2013，49(5):176-181.

［20］ MOE K T，ZHAO W G，SONG H S，et al.Development of SSR markers to study diversity in the genus Cymbidium［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2010，38(4):585-594.

［21］ MA Q H，WANG G X，LIANG L S.Development and characterization of SSR markers in Chinese jujube(Ziziphus jujuba Mill.)and its related species［J］.Scientia Horticulturae，2011，129(4):597-602.