遼東楤木體細(xì)胞組織培養(yǎng)研究*

張?jiān)骑L(fēng)，徐睿智，樊娜，馬琳

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

遼東楤木體細(xì)胞組織培養(yǎng)研究*

張?jiān)骑L(fēng)，徐睿智，樊娜，馬琳

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

通過查閱和整理國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，簡述了遼東楤木體細(xì)胞組織培養(yǎng)研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展。目前遼東楤木可以通過兩種途徑獲得再生苗,一條途徑是胚狀體成苗，另一條途徑是分割叢生芽誘導(dǎo)生根成苗。而在遼東楤木體細(xì)胞胚和叢芽的誘導(dǎo)過程中，外植體、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)條件（接種量、pH值、糖濃度、光照等）均為其關(guān)鍵因素。

遼東楤木；體細(xì)胞；組織培養(yǎng)；外植體

遼東楤木[Aralia elata（Miq．）Seem.]又稱龍芽楤木，刺老鴉，為五加科楤木屬植物灌木或小喬木。主要分布于遼寧、吉林、黑龍江、朝鮮、日本等地[1]。遼東楤木具有較高的藥用和食用價值。它的根皮可入藥，其中含有多種皂苷類成分,如齊墩果酸苷、羅盤草苷、竹節(jié)人參皂苷、屏邊三七皂苷等，另外還含有生物堿、揮發(fā)油、香豆素、豆甾醇及β-谷甾醇等成分[2-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、鎮(zhèn)靜、利尿、強(qiáng)心、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病并發(fā)癥等作用[5-7]。它的嫩芽含有人體所需的多種氨基酸、維生素和大量的蛋白質(zhì)、脂肪、糖，以及鈣、磷、鐵等多種微量元素，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是一種珍貴的藥食蔬菜[8]。由于種子細(xì)小自然繁殖率低，再加上過度采挖，遼東楤木的野生資源正在迅速減少?，F(xiàn)在生產(chǎn)上主要采用無性繁殖,用莖或根段扦插繁殖。由于遼東楤木分枝少,無性繁殖需采集大量的扦插材料,對野生資源破壞嚴(yán)重。為了滿足市場對種苗的需求和積極保護(hù)野生植物資源,采用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖是保持遼東楤木優(yōu)良性狀,加快繁殖速度的有效途徑[9]。本文對近幾年遼東楤木植物組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為遼東楤木植物資源種苗規(guī)?；M培繁育提供參考。

1 愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.1 基本培養(yǎng)基遼東楤木組織培養(yǎng)中以MS培養(yǎng)基最為常用，麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（MA培養(yǎng)基）的應(yīng)用也有報道。李福安等[10]研究了基本培養(yǎng)基對胚胎發(fā)生頻率的影響，結(jié)果表明低鹽、低銨離子（NH4+）濃度MA培養(yǎng)基易于誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織；而高鹽、高NH4+濃度的MS培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生。

1.2 外植體和組織培養(yǎng)條件遼東楤木組織培養(yǎng)中采用的外植體以營養(yǎng)器官為主，主要包括幼葉、幼嫩葉柄、嫩莖、芽（頂芽、腋芽、休眠芽）。趙恒田等[11]以莖尖、幼葉、嫩莖、休眠芽為外植體，以MS+0.1mg/L萘乙酸（NAA）+2.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤、細(xì)胞分裂素（6-BA）誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果以幼葉的出愈率最高，為90%，嫩莖、莖尖依次為86.6%、83.3%。李正楠等[12]利用遼東楤木葉片、葉柄、嫩莖及根為試材，以MS+（2，4-二氯苯氧基）乙酸（2，4-D）1.0 mg/L為培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)均可不同程度地誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，其中嫩莖誘導(dǎo)愈傷組織及胚狀體最好。秦亞平等[9]對遼東楤木的葉片、葉柄、幼莖在MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明：葉片的誘導(dǎo)效果最好，出愈率為37.1%。李建民等[13]發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)基［MA+0.5～3 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L細(xì)胞分裂素（BA）］上，莖較葉易于誘導(dǎo)愈傷組織，兩者平均誘導(dǎo)率分別為77%、63.8%。

此外還有報道[14]，先以種胚在1/2 MS培養(yǎng)基中，使胚萌發(fā)成無菌種苗，再將其根部做為外植體接種到培養(yǎng)基［1/2 SH＋3.0 mg/L吲哚丁酸（IBA）＋0.2 mg/L激動素（KT）］中誘導(dǎo)胚性愈傷組織，并在同樣條件下進(jìn)行愈傷組織的增殖。

1.3 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比遼東楤木組織培養(yǎng)中應(yīng)用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要為生長素類［2，4-D，NAA，吲哚-3-乙酸（IAA），IBA］和細(xì)胞分裂素類（BA，6-BA）兩大類。不同種類和濃度配比的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對外植體的分化和成苗的影響很大。

韓建軍[15]對野外采集的嫩芽進(jìn)行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為添加1.0 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d左右，開始出現(xiàn)愈傷組織，30 d左右形成瘤狀愈傷組織塊。秦亞平等[9]在遼東楤木的組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中加不同配比的2，4-D和6-BA，對愈傷組織的誘導(dǎo)率有很大影響，誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度的增加而增加，但濃度到1.5 mg/L時誘導(dǎo)率開始下降；在適當(dāng)增加2，4-D濃度的同時，加入少量的6-BA可提高誘導(dǎo)率。李建民等[13]實(shí)驗(yàn)得到類似的結(jié)論,2，4-D質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/L，遼東楤木愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳且褐化率低，當(dāng)質(zhì)量濃度升至3.0 mg/L時，則呈現(xiàn)下降趨勢。李福安等[10]在對體細(xì)胞胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)2，4-D濃度由0.5mg/L提高到2.0mg/L時愈傷組織才由非胚性愈傷組織形成胚性愈傷組織，但當(dāng)2，4-D濃度繼續(xù)提高時，愈傷組織褐化，生長不佳；另外BA與適宜濃度生長素配比，可能起初對愈傷組織胚胎發(fā)生的形成有促進(jìn)作用，而在其后發(fā)育中，則抑制胚狀體的形成。

與2，4-D相比，NAA可能更有利于胚胎發(fā)生及胚狀體的形成。陳國雙等[16]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段NAA從0到2.0 mg/L，隨著濃度增大愈傷組織加大，NAA達(dá)到2.0 mg/L時，不定芽有“玻璃化”現(xiàn)象出現(xiàn)，相同濃度NAA較IAA效果好。

1.4 培養(yǎng)條件

1.4.1 溫度和光照大多數(shù)文獻(xiàn)報道，遼東楤木組織培養(yǎng)的溫度以25℃左右，光強(qiáng)500～2 000 lx為宜。

1.4.2 pH和接種量王彥為等[17]在基質(zhì)pH和接種量對遼東楤木愈傷組織培養(yǎng)的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，遼東楤木愈傷組織培養(yǎng)的最佳pH為5.6，最佳接種量為每瓶0.8 g。

1.4.3 蔗糖濃度和活性炭李福安等[10]報道，適宜濃度的蔗糖（4%）對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有利,在胚胎發(fā)生過程中，2%的蔗糖有利于胚狀體的產(chǎn)生；活性碳對遼東楤木胚狀體發(fā)生頻率和形態(tài)都有重要的作用，0.2%的活性碳使其胚胎發(fā)生率較高，胚狀體質(zhì)量較好。

2 再生植株的形成

遼東楤木的根、莖、葉、葉柄、芽均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，愈傷組織的類型與形態(tài)發(fā)生能力有一定相關(guān)性。李建民等[13]報道，遼東楤木的愈傷組織在分化培養(yǎng)中形成了密布白色霜狀物的塊狀、綠色瘤狀、黃褐色顆粒狀三類愈傷組織，白色霜狀愈傷組織分化出不定芽，可沿愈傷組織途徑誘導(dǎo)出芽生根形成再生植株；而黃褐色顆粒狀愈傷組織上分化出了胚狀體，可沿胚狀體途徑形成再生植株。再生植株的形成共有兩條途徑。

以胚狀體進(jìn)行無性繁殖，誘導(dǎo)率和分化率均較高，繁殖速度快，生產(chǎn)集中，管理方便，是很好的繁殖手段，但是胚狀體為單細(xì)胞起源，變異幾率較大。

從遼東楤木外植體誘導(dǎo)愈傷組織中，篩選出可再分化的愈傷組織，誘導(dǎo)其分化出芽再分化出根，最后生長發(fā)育為再生植株。

2.2.1 出芽培養(yǎng)芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)受激素的種類、濃度、外植體的類型及繼代培養(yǎng)時間的影響很大。秦亞平等[9]對5組不同激素濃度的分化培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L培養(yǎng)基分化效果最好，平均誘導(dǎo)分化率為85%。趙恒田等[11]在不定芽分化的實(shí)驗(yàn)中表明最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（或IAA 0.2 mg/L），最適于誘導(dǎo)出芽的外植體為幼葉，30 d繼代1次分化效率最高，可達(dá)73%。李建民等[13]研究發(fā)現(xiàn)來源于葉的白色霜狀愈傷組織在MA+BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MA+BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L、MA+BA 3 mg/L+NAA 0.5 mg/L 3種培養(yǎng)基上分別形成叢生或單個粗壯的不定芽，分化率分別為10%、14.3%、6.7%。

GA3（赤霉素的一種類型）有促進(jìn)已分化的芽伸長生長的作用[15]，陳國雙等[16]研究了不同濃度GA3對不定芽的影響，結(jié)果表明，添加GA3的濃度以0.2 mg/L為宜，分化指數(shù)達(dá)6.12，濃度過高易引起叢生芽細(xì)弱和分化指數(shù)降低。

2.2.2 生根培養(yǎng)遼東楤木生根比較容易，生長素類生長調(diào)節(jié)劑以IBA（0.5～1.5 mg/L）、IAA（0.1～0.4 mg/L）最為常用，細(xì)胞分裂素類（BA、6-BA）不添加或低濃度（0.1 mg/L）添加[9-11，18-24]。秦亞平等[9]以MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L為培養(yǎng)基，21 d左右長出白色的根，主根上生有側(cè)根2～3條。趙恒田等[11]研究了不同濃度NAA對生根的影響，結(jié)果表明1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基最適于誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)20 d左右生根達(dá)高峰，生根率100%，平均每株生根3.1條，平均根長2.7 cm。李建民等[13]將不定芽接種到1/2 MA培養(yǎng)基上，20 d即可長出根系。陳國雙等[16]設(shè)置不同濃度NAA、BA、IBA，以1/2 MS+BA 0.1 mg/L+ IBA 0.5 mg/L進(jìn)行生根培養(yǎng)最好，生根率92%，平均每株生根4.8條。

3 試管苗的移栽

試管苗是否移栽成活直接關(guān)系到組織培養(yǎng)繁育能否應(yīng)用于生產(chǎn)。趙恒田等[11]報道按1∶1混配的蛭石與草炭為試管苗移栽最適基質(zhì),移栽成活率在89%以上，且植株生長良好。陳國雙等[16]研究表明，以珍珠巖+落葉松腐殖土（1∶1）煉苗效果好，能加速成苗。金今松等[25]在遼東楤木試管苗移栽的研究中表明，試管苗移栽的適宜形態(tài)指標(biāo)是3～4葉期；在溫度25℃左右，濕度60%～85%，苗的成活率最高。

4 遼東楤木組織培養(yǎng)常見問題及解決

4.1 褐化在植物組織培養(yǎng)初期，外植體易發(fā)生褐變現(xiàn)象，褐化會使組織難以培養(yǎng)，甚至失敗，故防止外植體褐變組織培養(yǎng)是不可忽視的關(guān)鍵。適宜的外源激素配比可有效防止外植體褐變。常迺滔等[18]以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，用NAA（0.01～0.05 mg/L）、6-BA（0.5～1.0 mg/L）的11個不同組合處理，誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明：（NAA 0.01 mg/L+6-BA 0.5 mg/L）誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織的褐化率最低。另外，有學(xué)者[9]在培養(yǎng)基中加入吸附劑活性炭，其中，5 g/L活性炭防止外植體褐化效果顯著。曹孜義等[26]在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑維生素C防止外植體褐變。此外還有研究[21]發(fā)現(xiàn)，將遼東楤木外植體不斷轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上亦可基本防止褐變現(xiàn)象。

4.2 玻璃化降低6-BA含量并把握好瓊脂加入量（7.5～8.0 g/L），可有效防止外植體玻璃化的產(chǎn)生[9]。

4.3 細(xì)菌污染報道發(fā)現(xiàn)[9]，40 μg/L的硫酸鏈霉素控制細(xì)菌的污染效果較好。另外，在培養(yǎng)基中加入青霉素可防止初代培養(yǎng)物的污染。

5 小結(jié)

由于遼東楤木的自然繁殖率低及人們的掠奪式開發(fā)，導(dǎo)致遼東楤木的野生資源日益減少?，F(xiàn)在生產(chǎn)上采用的無性扦插技術(shù)，需耗費(fèi)大量根、莖,不利于野生資源的保護(hù)。為了滿足市場需求和積極保護(hù)野生資源,采用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖是保持遼東楤木優(yōu)良性狀,加快繁殖速度的有效途徑。近年來，國內(nèi)外的學(xué)者對其進(jìn)行了大量的研究，無論是胚狀體成苗還是愈傷組織成苗途徑都獲得了一定的成果。但是遼東楤木的組織培養(yǎng)仍存在一些問題，如再生苗是否保持了優(yōu)良的性狀，再生苗的病蟲害防治和成活率及如何實(shí)現(xiàn)遼東楤木組織培養(yǎng)的工業(yè)化，這些問題仍需進(jìn)一步研究。

[1]程貴蘭.遼東楤木根段繁殖技術(shù)[J].北方園藝,2012，35(3): 51.

[2]姜永濤,徐綏緒.遼東楤木的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,1991,28(3):229-233.

[3]姜永濤,徐綏緒,陳英杰，等.遼東楤木化學(xué)成分的研究(1)[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1991,28（4）:265-268.

[4]姜永濤,徐綏緒,姚新生，等.遼東楤木的化學(xué)成分及藥理活性研究[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,1991,28（4）:290.

[5]唐力,牟雅軍,于廣晴.龍牙楤木總苷對小鼠免疫功能的抑制作用[J].佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1994,17(3):14-15.

[6]Wang ZG,Song SJ,Lu HW,et al.Effect of three triterpenoid compounds isolated from root bark of Aralia elata on stimulus-induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation and translocation of p47phox and p67phox to cell membrane in human neutrophil[J].Clin Chim Acta,2003, 336(1-2):65-72.

[7]Yagi-Chaves SN,Liu G,Yamashita K,et al.Effect of five triterpenoid compounds isolated from root bark of Aralia elata on stimulus-induced superoxide generation,tyrosyl or serine/threonine phosphorylation and translocation of p47 (phox),p67(phox),and rac to cell membrane in human neutrophils[J].Arch biochem Biophvs,2006,446(1):84-90.

[8]楊國宏,周建,宋長春，等.遼東楤木葉中甙類成分的化學(xué)研究[J].中草藥,1995,26(10):514-517.

[9]秦亞平,吳大椿,肖錦和，等.龍牙楤木組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,32(1):111-114.

[10]李福安,李建民,李喜文，等.培養(yǎng)因素對龍牙楤木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,2004,41 (6):1259-1263.

[11]趙恒田,宋曉宏,沈云霞，等.遼東楤木愈傷組織誘導(dǎo)及增殖技術(shù)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2008,24(1):64-67.

[12]李正楠,王紅,張愛軍，等.龍芽楤木體細(xì)胞胚狀體發(fā)生及成苗的調(diào)控研究[J].北方園藝,2010,33（8）:118-121.

[13]李建民,李喜文,李福安，等.龍牙楤木組織培養(yǎng)與不定芽再生植株[J].青海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,2004,25 (4):69-72.

[14]Dai JL，Tan X,Zhan YG,et al.Rapid and repetitive plant regenerationofAraliaelataSeem.viasomatic embryogenesis[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2011,104(1):125-130.

[15]韓建軍.龍芽楤木的組織培養(yǎng)[J].中國林副特產(chǎn)，2001,15 (4)：2.

[16]陳國雙,邵慶春.龍牙楤木組織培養(yǎng)和快速繁殖的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,25(4):400-403.

[17]王彥為,陶麗華,丁金干，等.基質(zhì)pH值和接種量對龍芽楤木愈傷組織培養(yǎng)的影響[J].人參研究,2005,17(4):18-19.

[18]常迺滔,于萍,雍一丘，等.遼東楤木的離體培養(yǎng)及植株再生研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,36(2):185-188.

[19]董衍奎，孫穎達(dá)，安文和，等.龍牙楤木的離體培養(yǎng)[J].中國林副特產(chǎn)，2005,19(6):22.

[20]謝永剛，矯天育，關(guān)麗霞.龍牙楤木的組織培養(yǎng)[J].遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2001,3(4):18-19.

[21]胡春霞，湯潔.遼東楤木的組織培養(yǎng)及植株再生[J].遼寧師專學(xué)報，2003,5(4):96-97.

[22]徐娥,李巖.遼東楤木的組培與快繁[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物,2005,8(11):31.

[23]潘國才,婁漢平,吳麗敏，等.遼東楤木組織培養(yǎng)快繁技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè),2009,27(4):70-71.

[24]孫桂波,葉景學(xué).龍牙楤木組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)[J].吉林蔬菜,2007,18(4):53.

[25]金今松,李甫永,樸泰浩.龍牙楤木組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究Ⅱ——試管苗移栽和田間栽培[J].中國野生植物, 1990，8（3）:37-40.

[26]曹孜義，劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1996:15.

A summarization on somatic cell tissue culture of Aralia Elata Seem

ZHANG Yun-feng,XU Rui-zhi,FAN Na,MA Lin
（College of TCM，Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

Through consulting and tidying up the related literature materials at home and abroad,this paper summarizes the main research progress on somatic cell tissue culture of Aralia elata.Regenerated plantlets of Aralia elata can be obtained by two ways,one is embryoid into plantlet,the other is divided cluster buds into roots and then inducing roots into seedlings.In the process of somatic embryo and cluster bud induction,explants,culture medium, growth regulating substances and cultivating conditions(inoculation quantity,pH value,sugar concentration, illumination,etc.)all are playing critical roles.

Aralia elata;somatic cell;tissue culture;explant

R285

A

1673－9043（2014）01－0052-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.18

2013-09-06）

天津市高等學(xué)?！笆濉本C合投資規(guī)劃專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)相關(guān)專業(yè)中藥資源與開發(fā)項(xiàng)目。

張?jiān)骑L(fēng)（1991－），女，天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2010級本科生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與開發(fā)。

馬琳，E-mail:malin7983@yahoo.com.cn。