陳裕坤,林玉玲,劉生財(cái),張梓浩,賴鐘雄
(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所,福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院園藝生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350002)
《植物組織培養(yǎng)脫毒苗病毒的PCR檢測(cè)》實(shí)驗(yàn)課課程開設(shè)研究
陳裕坤,林玉玲,劉生財(cái),張梓浩,賴鐘雄*
(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所,福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院園藝生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350002)
植物組織培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分,隨著PCR檢測(cè)技術(shù)在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用,PCR法檢測(cè)脫毒苗病毒實(shí)驗(yàn)課程的建立顯得尤其重要。以香蕉試管苗束頂病病毒的PCR檢測(cè)為例建立了新的實(shí)驗(yàn)課程,在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)課程安排及實(shí)驗(yàn)考核等方面進(jìn)行了研究和探索。經(jīng)過3年的有益實(shí)踐表明,該課程取得了較好的教學(xué)效果,提高了大學(xué)生的科研能力和植物組織培養(yǎng)應(yīng)用技能。
植物組織培養(yǎng);脫毒苗;病毒;PCR檢測(cè);實(shí)驗(yàn)課程
植物組織培養(yǎng)是一門應(yīng)用性、實(shí)踐性強(qiáng)的專業(yè)課程,實(shí)驗(yàn)課的重要性尤為突出,其在要求學(xué)生掌握基本實(shí)驗(yàn)技能的同時(shí),還要求學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)解決生產(chǎn)中面臨的實(shí)際問題[1-4]。福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物生物工程研究所在1992年就已開設(shè)了《園藝植物組織培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程[5],這門實(shí)驗(yàn)課程的主要內(nèi)容為工廠化生產(chǎn)車間的設(shè)計(jì)、培養(yǎng)基配制、外植體消毒與接種、繼代增殖等。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,PCR檢測(cè)技術(shù)成為香蕉[6-7]、非洲菊[8]、甜櫻桃[9]、甌柑[10]、馬鈴薯[11-12]、草莓[13]等植物組織培養(yǎng)脫毒苗病毒檢測(cè)的最重要手段之一。但目前的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教材幾乎沒有涉及這方面的內(nèi)容,因此,該實(shí)驗(yàn)室在前人的基礎(chǔ)上依據(jù)實(shí)驗(yàn)課程開設(shè)的要求,結(jié)合實(shí)驗(yàn)樣品取材與本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)課的科學(xué)性、可執(zhí)行性等因素,以香蕉試管苗的束頂病病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的PCR檢測(cè)為例,新開設(shè)了《植物組織培養(yǎng)脫毒苗病毒的PCR檢測(cè)》這門實(shí)驗(yàn)課程,在實(shí)驗(yàn)課程建立、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)課程安排和實(shí)驗(yàn)考核等方面進(jìn)行研究和探索,以提高大學(xué)生的科研能力和組織培養(yǎng)應(yīng)用技能。
1.1 目的要求
通過實(shí)驗(yàn)課程掌握?qǐng)@藝植物試管苗病毒的PCR檢測(cè)方法,能自行設(shè)計(jì)試驗(yàn)解決生產(chǎn)上面臨的實(shí)際問題。
1.2 儀器設(shè)備與試劑
1.2.1 儀器設(shè)備。PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、超微量紫外可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、微波爐、移液器、純水系統(tǒng)、制冰機(jī)、冰箱、高壓鍋、離心管、PCR管等。
1.2.2 試劑。植物總DNA提取相關(guān)試劑、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、rTaq酶、10×PCR Buffer、DNA Marker、dNTP Mix、Loading Buffer等。
1.3 實(shí)驗(yàn)材料
以香蕉試管苗為檢測(cè)材料,以經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)帶束頂病的香蕉試管苗為陽性對(duì)照材料,以無病毒香蕉試管苗為陰性對(duì)照材料。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 香蕉基因組DNA的提取。采用改良CTAB法[14]提取香蕉葉片的基因組DNA(圖1)。再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、超微量紫外可見分光光度計(jì)法檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量、純度和濃度,選取A260/A280為1.8~2.0的總DNA,稀釋至20 ng/μL,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
圖1 香蕉基因組DNA提取
1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的多個(gè)BBTV株系的復(fù)制酶基因的高度保守序列處設(shè)計(jì)1對(duì)上下游引物,用于香蕉束頂病毒復(fù)制酶基因的擴(kuò)增。引物序列為BBTV-F:5′-ATGGCGCGATATGTGGTATG-3′;BBTV-R:5′-TCAGCAAGCAACTAGCTTTATTC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)為860 bp左右。引物由華大基因公司合成,用ddH2O溶解至終濃度為10 μmol/L后,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.3 PCR檢測(cè)體系。PCR檢測(cè)體系總體積為25 μL:香蕉DNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mix(2.5 mmol/L)2 μL,rTaq(5 U/μL)0.2 μL,補(bǔ)ddH2O至總體積為25 μL。
1.4.4 PCR擴(kuò)增程序。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置:94℃預(yù)變性3 min,(94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸45 s)總共35個(gè)循環(huán),最后再72℃終延伸10 min。調(diào)整好反應(yīng)程序,將上述混合物稍加離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
1.4.5 電泳分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20 min(電壓180 V,電流180 mA)后,于凝膠成像系統(tǒng)中拍攝電泳結(jié)果圖,并對(duì)PCR檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)分析。如圖2所示,3、4、6、10的試管苗與陽性對(duì)照1的檢測(cè)結(jié)果相一致,均檢測(cè)出860 bp左右的目的片段,初步判斷其可能感染了束頂病病毒;而5、7、8、9的試管苗與陰性對(duì)照2的檢測(cè)結(jié)果相同,未檢測(cè)出目的片段,說明其可能不帶束頂病病毒,試管苗脫毒成功。
圖2 香蕉束頂病病毒電泳檢測(cè)結(jié)果
1.4.6 PCR產(chǎn)物的序列分析及驗(yàn)證。將與陽性對(duì)照相一致的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后連接到PMD-18T載體上,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的克隆子送深圳華大基因公司測(cè)序。序列測(cè)定結(jié)果表明,BBTV擴(kuò)增片段為861 bp(圖3),符合預(yù)期產(chǎn)物大小,是BBTV DNA的部分序列。與GenBank中香蕉其他眾多BBTV株系的復(fù)制酶基因分離物的相似性在96%~98%,表明該實(shí)驗(yàn)方法能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出香蕉試管苗是否攜帶束頂病病毒,可將該方法應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。
圖3 香蕉束頂病病毒(BBTV)擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果
2.1 準(zhǔn)備工作
無毒香蕉試管苗和感染束頂病病毒的香蕉試管苗由實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、保存;儀器設(shè)備、PCR相關(guān)試劑,高壓滅菌的槍頭、離心管與PCR管等耗材由老師課前備好待用;植物總DNA提取緩沖液等配制由老師課前配制好備用。
2.2 課程安排
目前,該實(shí)驗(yàn)課程主要面向福建農(nóng)林大學(xué)的園藝、園林等專業(yè)授課,每年的學(xué)生人數(shù)近200人,因此實(shí)驗(yàn)課程的安排以小班的形式進(jìn)行,每班30人左右分6個(gè)小組,即每個(gè)小組5人。課程學(xué)時(shí)為3學(xué)時(shí),課程內(nèi)容包括上述的DNA提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以及撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。其中DNA提取2 h,PCR擴(kuò)增2 h,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)約20 min,實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫由學(xué)生課后完成。
2.3 考核
傳統(tǒng)的《園藝植物組織培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)課程考核主要采取“考勤+實(shí)驗(yàn)報(bào)告”的方式,無法客觀的體現(xiàn)教學(xué)效果。因此,需要對(duì)傳統(tǒng)的考核機(jī)制進(jìn)行改革,該實(shí)驗(yàn)課程從DNA提取、PCR擴(kuò)增體系建立、PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳等過程對(duì)學(xué)生的操作技能有較高的要求,因此考核以出勤、任務(wù)完成、實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫為依據(jù)設(shè)計(jì)考核辦法??己顺煽?jī)由出勤、任務(wù)完成、實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)報(bào)告組成,比例為1∶2∶3∶4。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)室向校教務(wù)處申請(qǐng)?jiān)撜n程的教學(xué)改革,增加實(shí)驗(yàn)成績(jī)?cè)凇秷@藝植物組織培養(yǎng)》課程中的比重,由原來的20%提高到30%,使學(xué)生充分認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要性,進(jìn)而增加學(xué)習(xí)的自主性,提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果。
植物組織培養(yǎng)技術(shù)在離體快繁、脫毒、遺傳改良、離體保存、次生代謝物生產(chǎn)、人工種子生產(chǎn)、試管花卉應(yīng)用以及植物學(xué)相關(guān)的教學(xué)和科研領(lǐng)域等發(fā)揮了重要作用。該實(shí)驗(yàn)室在前人的基礎(chǔ)上,根據(jù)目前工廠化育苗生產(chǎn)上的需要,開設(shè)了《園藝植物組織培養(yǎng)脫毒苗病毒的PCR檢測(cè)》實(shí)驗(yàn)課程,經(jīng)過3年的實(shí)踐,證明該實(shí)驗(yàn)開設(shè)很有必要,并且學(xué)生學(xué)習(xí)效果和熱情都很高。通過在實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)的不斷優(yōu)化和改進(jìn),取得了良好的教學(xué)效果,提高了大學(xué)生的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技能和組織培養(yǎng)應(yīng)用技能。同時(shí)使大學(xué)生具備一定的科研能力,在解決生產(chǎn)面臨實(shí)際問題的時(shí)候能自行設(shè)計(jì)試驗(yàn)解決問題,增強(qiáng)其社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)力,為許多教學(xué)科研單位、生物工程公司及組織培養(yǎng)相關(guān)農(nóng)業(yè)企業(yè)輸送了大量熟練應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的人才。
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(責(zé)任編輯 金蘋)
Establishment of the Experimental Course “Detecting Virus of Virus-free Seedlings from Plant Tissue Culture by PCR Assay”
CHEN Yu-kunet al.(Institute of Horticultural Biotechnology,Teaching Lab of Horticultural Biotechnology of Horticulture College,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)
Plant tissue culture is an important part of modern biotechnology,and with the wide applications of PCR detection technology to the production,to establish an experimental course of detecting the virus of virusfree seedlings by PCR assay is especially important.This article took the PCR detection of banana tube seedling banana bunchy top virus(BBTV)as an example to establish a new experimental course,which studied and explored the design of the experimental content,optimization of the experiment method,arrangement of the experimental curriculum and the examination of the experiment course,etc.It has been proved to be beneficial to improvement of the experimental teaching effects and the university students'abilities of research and application skills for plant tissue culture by threeyears practice.
Plant tissue culture;Virus-free seedling;Virus;PCR detection assay;Experimental course
Q813.1+2,C41
A
2095-0896(2014)10-032-03
福建農(nóng)林大學(xué)園藝特色專業(yè)建設(shè)點(diǎn)項(xiàng)目(111zt0903);福建農(nóng)林大學(xué)本科教學(xué)改革立項(xiàng)項(xiàng)目(111409017);福建農(nóng)林大學(xué)本科考試改革試點(diǎn)課程(農(nóng)林大教字[2011]65號(hào));福建農(nóng)林大學(xué)本科教學(xué)改革項(xiàng)目(111412099)。
陳裕坤(1984-),男,福建龍巖人,助理實(shí)驗(yàn)師,博士研究生,從事園藝植物生物技術(shù)研究。*通訊作者,研究員,博士,博士生導(dǎo)師,從事植物生物技術(shù)研究。
2014-08-11