多重PCR鑒定三種顎口線蟲方法的建立

李樹清，李雯雯，張鴻滿，陳韶紅，李 健，陳志飛，王巧全，張永年，黃維義

（1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，廣州 510080；3. 廣西疾病預(yù)防控制中心，南寧 530021； 4. 中國疫病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，上海 200025；5. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

多重PCR鑒定三種顎口線蟲方法的建立

李樹清1，李雯雯2，張鴻滿3，陳韶紅4，李 健5，陳志飛1，王巧全1，張永年4，黃維義5

（1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，廣州 510080；3. 廣西疾病預(yù)防控制中心，南寧 530021； 4. 中國疫病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，上海 200025；5. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

為了建立快速、靈敏、可靠的鑒別顎口線蟲蟲種的方法，根據(jù)GenBank中發(fā)表的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲和杜氏顎口線蟲ITS-2序列，設(shè)計(jì)了3對特異引物，建立了這3種顎口線蟲的單一PCR和多重PCR檢測方法，并分別對單一PCR和多重PCR方法的特異性和敏感性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示單一PCR和多重PCR均能特異擴(kuò)增出棘顎口線蟲、日本顎口線蟲和杜氏顎口線蟲，其片段大小分別為282、358、183 bp，單一PCR對棘顎口線蟲、日本顎口線蟲和杜氏顎口線蟲蟲體DNA最小檢出量分別為0.2、0.01、0.01 ng/μL。對宮脂線蟲、異尖線蟲、棘口吸蟲以及迭宮絳蟲均不能進(jìn)行擴(kuò)增。用建立的多重PCR方法對菲律賓、印度尼西亞、黑龍江顎口線蟲等12條顎口線蟲DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)鑒定菲律賓與印度尼西亞的顎口線蟲為棘顎口線蟲，黑龍江的顎口線蟲為日本顎口線蟲。鑒定結(jié)果與原蟲體樣本的形態(tài)鑒定和測序分析結(jié)果一致。研究顯示建立的多重PCR方法具有很強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，可用于棘顎口線蟲、日本顎口線蟲和杜氏顎口線蟲蟲種的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。

棘顎口線蟲；日本顎口線蟲；杜氏顎口線蟲；多重PCR；蟲種鑒定

顎口線蟲病是因人食入生的或未熟的含有顎口屬（Gnathostoma）幼蟲的淡水魚引起的人畜共患寄生蟲病。顎口線蟲屬有13個(gè)有效種，目前已報(bào)道的致病種有棘顎口線蟲（G.spinigerum）、剛刺顎口線蟲（G.hispidum）、杜氏顎口線蟲（G.doloresi）、日本顎口線蟲（G.nipponicum）、馬來顎口線蟲（G.malaysiae）和雙核顎口線蟲（G.binucleatum），對食品中檢出的顎口線蟲幼蟲蟲種的鑒別對該病的診斷與防治有重要意義[1,2]。顎口線蟲種類傳統(tǒng)的鑒定方法是以形態(tài)特征為鑒別指標(biāo)，但顎口線蟲的生活史復(fù)雜，不同發(fā)育階段形態(tài)變化較大，有些蟲種的第三期幼蟲形態(tài)相似，傳統(tǒng)形態(tài)方法很難鑒別，因而不能作為蟲種鑒別的精確指標(biāo)，且傳統(tǒng)方法也費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

多重PCR（multiplex PCR），又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上2對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，該技術(shù)可以高效、系統(tǒng)、經(jīng)濟(jì)、簡便的應(yīng)用于同時(shí)檢測或鑒定病原微生物，及某些遺傳病和癌基因的分型鑒定。寄生蟲種類鑒別研究的目的基因多以核糖體DNA（rDNA）為主。真核生物rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）包括ITS-1和ITS-2，進(jìn)化較快，具有種間特異性和種內(nèi)保守性，是進(jìn)行種間分類的極好材料，可設(shè)計(jì)特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且可以通過比較ITS序列的差異來鑒定形態(tài)學(xué)上難以區(qū)別的近緣種[3,4]。根據(jù)ITS序列用多重PCR方法來鑒別顎口線蟲蟲種，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。棘顎口線蟲、杜氏顎口線蟲、日本顎口線蟲是亞洲最常見的3種顎口線蟲致病種，本研究根據(jù)ITS-2序列，分別設(shè)計(jì)這3種顎口線蟲的特異引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，旨在建立一種快速、靈敏、可靠的鑒別顎口線蟲種類的方法。

1 材料與方法

1.1 蟲種G.spinigerum、G.doloresi由廣西疫病預(yù)防控制中心張鴻滿主任醫(yī)師惠贈，G.nipponicum由本室從泥鰍中分離，3種標(biāo)準(zhǔn)蟲種已經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。其ITS2基因序列GenBank登錄號分別為：JN408326、JN408329和JN408315，CO1基因序列登錄號分別為JN408310、JN408299和JN408298。蟲體保存于70%乙醇中。

1.2 對照蟲種宮脂線蟲（Hysterothylacium）、異尖線蟲（Anisakis）由本室保存；棘口吸蟲（Echinostoma）、迭宮絳蟲（Spirometra）分別由廣西大學(xué)黃維義教授與廣西疫病預(yù)防控制中心張鴻滿主任醫(yī)師惠贈。

1.3 待鑒定樣品待鑒定樣品為2010年～2011年分離自菲律賓、印度尼西亞進(jìn)口黃鱔與黑龍江泥鰍的顎口線蟲。2條菲律賓與8條印度尼西亞分離的顎口線蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定為G.spinigerum（ITS2登錄號：JN408316～JN408325，CO1登錄號為JN408300～JN408309）；2條黑龍江分離的顎口線蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定為G.nipponicum（ITS2登錄號為JN408313和JN408314，CO1登錄號為JN408296和JN408297）。

1.4 主要試劑Taq聚合酶、PCR試劑、DNAMarker（DL500）購自寶生物工程有限公司；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.5 儀器及設(shè)備梯度PCR擴(kuò)增儀（美國AppliedBiosystems公司）、電泳儀（美國Labnet公司）、G：BOX凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成從GenBank中獲得G.spinigerum（AB181155）、G.doloresi（AB181156）、G.nipponicum（AB181157）ITS2序列，應(yīng)用DNAStar7.0分子生物學(xué)軟件分析后設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Primers used in multiplex PCR

1.7 蟲體DNA提取從70%乙醇保存液中取出單個(gè)蟲體，置于1.5 mLEppendorf管中，用蒸餾水反復(fù)浸泡清洗3次，每隔2h換水1次，按照QIAGEN公司DNA提取試劑盒（DNeasyBlood&Tissuekit）使用說明書提取顎口線蟲基因組DNA，將提取的基因組DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化25μL的反應(yīng)體系：25mmol／LMg2+2.5μL、10×PCRbuffer2.5μL、2.5mmol／LdNTP1μL、5U／μLTaq聚合酶0.1μL、適當(dāng)濃度的上游和下游引物、DNA模板1μL。以抽提的DNA為模板，對PCR各循環(huán)參數(shù)、退火溫度和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的PCR模式。

1.9 單一PCR擴(kuò)增將上述提取的3種顎口線蟲DNA分別用各自的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL反應(yīng)體系：10×buffer2.5μL、Mg2+2.5μL（25mmo1）、dNTP1μL（2.5mmol)、上下游引物各0.5μL（10μmo1)、Taq聚合酶0.1μL（5U／μL)、模板DNA1μL，加滅菌ddH2O至25μL。反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。

1.10 多重PCR擴(kuò)增25μL反應(yīng)體系：10×buffer2.5μL、Mg2+2.5μL(25mmo1)、dNTP1μL(2.5mmol)、G.doloresi與G.nipponicum上下游引物各0.3μL(10μmo1/L)、G.pinigerum上下游引物各0.4μL(10μmo1/L)。Taq聚合酶0.1μL（5U／μL）、模板DNA各1μL，加滅菌ddH20至25μL。操作程序和反應(yīng)參數(shù)同上。

1.11 PCR擴(kuò)增的特異性單一PCR：用G.spinigerum、G.doloresi或G.nipponicum的單一引物，分別對G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum、Hysterothylacium、Anisakis、Echinostoma與Spirometra的DNA模板，在同等條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，以鑒定其特異性；多重PCR：同時(shí)用3對引物，分別對G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum及其不同組合、Hysterothylacium、Anisakis、Echinostoma與Spirometra的DNA模板，在同等條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，以鑒定其特異性。

1.12 PCR擴(kuò)增的敏感性以10倍梯度稀釋法分別將G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum3種顎口線蟲的DNA模板稀釋成5個(gè)濃度梯度，按以上條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定單一PCR和多重PCR反應(yīng)的敏感性。

1.13 對檢疫樣品的檢測將各地檢出的顎口線蟲蟲體（均經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定），提取DNA模板，按上述建立的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 顎口線蟲DNA模板的制備結(jié)果將3種顎口線蟲所提取的DNA經(jīng)分光光度計(jì)測定，OD260／OD280在1.8～2.0范圍內(nèi)，純度符合PCR要求。

2.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果單一引物擴(kuò)增相應(yīng)蟲種DNA模板時(shí)，退火溫度在55℃～61℃ 時(shí)條帶無明顯差異變化；3對引物混合擴(kuò)增3個(gè)蟲種的混合DNA模板時(shí)，51℃和53℃退火溫度G.doloresi條帶稍暗，當(dāng)退火溫度在55℃～61℃時(shí)各條帶最亮，且無非特異性條帶（圖1）。最后選用55℃作為多重PCR退火溫度，多重PCR引物最佳混合比例：G.doloresi、G.nipponicum上下游引物各0.3μL（10 μmo1/L），G.spinigerum上下游引物各0.4μL（10 μmo1/L）。

圖1 棘顎口（A）、杜氏顎口（B）、日本顎口(C)單一PCR和多重PCR（D）退火溫度的確定Fig.1 Agarose gel electrophoresis of single PCR for G. spinigerum （A）, G. doloresi （B）, G. nipponicum（C）and multiplex PCR（D）amplif cation products

2.3 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果及特異性單一PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)3.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum分別擴(kuò)增出1條282、183和358 bp的條帶，與各自的預(yù)期相符；3種引物對Hysterothylacium、Anisakis、Echinostoma與Spirometra均未擴(kuò)增出任何條帶（圖2）。G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum單一PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析后，結(jié)果顯示與該3種顎口線蟲的ITS2目的基因序列相吻合。

2.4 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果及其特異性同時(shí)用3對引物分別對G. spinigerum、G. doloresi和G. nipponicum的單一DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出1條目的條帶（圖3：泳道5～7）；對G.spinigerum與G. doloresi、G.spinigerum與G.nipponicum和G.doloresi與G.nipponicum3種不同組合的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出2條目的條帶（圖3：泳道2～4），而對Hysterothylacium、Anisakis、Echinostoma、SpirometraDNA 均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖3：泳道8～11）；對G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum3種顎口線蟲的混合DNA 模板，擴(kuò)增出3條目的條帶（圖3：泳道1）。

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)不同稀釋濃度的DNA模板按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，G.doloresi、G.nipponicum、G.spinigerumDNA模板原濃度分別133、125、204 ng/μL。單一PCR對G.doloresi、G.nipponicum和G.spinigerum的最小檢出量分別為0.01、0.01、0.2 ng/μL?；旌夏０宥嘀豍CR最小檢出量與單一PCR相同（圖4）。

2.6 臨床蟲種的鑒定用建立的多重PCR方法對2條菲律賓、8條印度尼西亞分離到的顎口線蟲的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，電泳條帶與G.spinigerum陽性對照的條帶位置一致，為282 bp；對2條黑龍江分離到的顎口線蟲DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，電泳條帶與G.nipponicum陽性對照條帶位置一致，為358 bp（圖5）。多重PCR鑒定結(jié)果與原樣品形態(tài)鑒定和分子鑒定結(jié)果完全相符。

圖2 單一引物PCR特異性Fig.2 Specif city of single PCR

圖3 3對引物多重PCR特異性Fig.3 Specif city of multiplex PCR

圖4 PCR敏感性試驗(yàn)Fig.4 PCR sensitivity assay

圖5 多重PCR方法鑒定樣品結(jié)果Fig.5 Sample test assay using multiplex PCR method

3 討論

顎口線蟲病流行病學(xué)調(diào)查和病例報(bào)告見于世界各地。國外主要流行于泰國、日本、印度、越南、孟買、柬埔寨、墨西哥等地[5-10]。我國已報(bào)道50多例，分布于16個(gè)?。ㄊ校?，其中以上海市、福建省及廣東省較為多見，蟲種以棘顎口線蟲為主，剛刺顎口線蟲和杜氏顎口線蟲病例偶見[11]。FAO（聯(lián)合國糧農(nóng)組織）已將寄生蟲列為水產(chǎn)品中生物危害因子之首[12]，其中包括顎口線蟲。隨著人們對食品安全的重視，水產(chǎn)品顎口線蟲的檢疫也需要有快速靈敏的蟲種鑒定方法作為輔助工具，本研究選擇多重PCR方法直觀且簡便快速，不需要太多復(fù)雜的步驟，便于檢疫工作者操作。

在建立多重PCR的檢測方法時(shí)，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，引物的長度、G+C含量、Tm值應(yīng)盡量一致，且各擴(kuò)增片段的大小要適宜，既要避免電泳不能分辨，又不能相差過大。在顎口線蟲屬中，各蟲種之間ITS-2基因序列有65%～89%的同源性，差異較大，并且ITS2序列較長，適合用于特異引物的設(shè)計(jì)，G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum3種顎口線蟲的ITS2同源性為75%～83%，差異較大易于特異引物的設(shè)計(jì)。本文研究設(shè)計(jì)的3對引物，GC 含量相近，Tm值相近，這就保證了在相同的退火溫度下，G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum都能得到很好的擴(kuò)增。其擴(kuò)增片段分別為282、183、358 bp，這使得在檢測時(shí)能在同一個(gè)電泳膠上進(jìn)行，為顎口線蟲多重PCR方法的成功奠定了基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)上顎口線蟲種類的鑒定主要依靠蟲體形態(tài)學(xué)特征，但不同種間幼蟲形態(tài)學(xué)特征區(qū)別較小，而同一蟲種在不同的中間宿主其大小也有差異，導(dǎo)致區(qū)分困難，鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前有對顎口線蟲CO1與ITS2設(shè)計(jì)通用引物分析鑒定蟲種的報(bào)道，但未見設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行蟲種鑒定的報(bào)道。本研究建立的鑒定方法顯示，無論是單一PCR還是多重PCR，均能特異性擴(kuò)增出G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum條帶，單一PCR與多重PCR敏感性一致，且敏感性能夠滿足對所提蟲體DNA濃度的要求，表明建立的方法具有很強(qiáng)的特異性和較高的敏感性。該方法僅通過條帶的位置就可以判定所屬的蟲種，不需要進(jìn)行測序等繁瑣費(fèi)時(shí)的步驟。將該方法運(yùn)用于樣品的鑒定，鑒定結(jié)果與蟲體形態(tài)學(xué)與序列分析結(jié)果一致[13,14]，表明該檢測方法的可靠性，證明了本研究建立的多重PCR方法能同時(shí)鑒定G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum3個(gè)種，可用于這3種顎口線蟲的診斷和種類調(diào)查。

Sugiyama等[15]對衛(wèi)氏并殖吸蟲進(jìn)行了ITS2特異引物研究，目前球蟲與錐蟲方面也有不少多重PCR檢測技術(shù)的研究，而在顎口線蟲方面本研究是首次對G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum3種顎口線蟲設(shè)計(jì)特異引物并建立多重PCR鑒定蟲種的方法，國內(nèi)外目前尚未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。由于條件的限制，本實(shí)驗(yàn)室只有這3種顎口線蟲，缺乏顎口線蟲其他蟲種的特異性對比，但本研究結(jié)果為今后建立更完善的顎口線蟲多重PCR蟲種鑒定方法奠定了基石，為檢驗(yàn)檢疫工作者提供了G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum3種顎口線蟲簡單、快速、靈敏的鑒定方法。

[1] Ligon B L. Gnathostomiasis: A review of a previously localized zoonosis now crossing numerous geographical boundaries[J]. Semin Pediatr infect Dis, 2005, 16(2): 137-143.

[2] Nomura Y, Nagakura K, Kagei N,et al.Gnathostomiasis possibly caused by Gnathostoma malaysiae[J]. Tokai J Exp Clin Med, 2000, 25(1):1-6.

[3] Almeyda-Artigas R J, Bargues M D, Mas-Coma S. ITS-2 rDNA sequencing of Gnathostoma species(nematoda) and elucidation of the species causing human Gnathostomasis in the Amercas[J]. J Parasitol, 2000, 86(3): 537-544.

[4] Hashimoto K, Watanabe T, Liu C X,et al.Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese Fasciola species is F. gigantica[J]. Parasitol Res, 1997, 83 (3), 220-225.

[5] Herman J S, Wall E C, Van-tulleken C,et al.Gnathostomiasis acquired by british tourists in botswana[J]. Emerq Infect Dis, 2009, 15(4): 594-597.

[6] Strady C, Dekumyoy P, Clement-riqolet M,et al.Longterm follow-up of imported gnathostomiasis shows frequent treatment failure[J]. Am J Trop Med Hyg, 2009 , 80(1): 33-35.

[7] Hennies F, Jappe U, Kapaun A,et al.Gnathostomiasis import from Laos[J]. J Dtsch Dermatol Ges, 2006, 4(5): 414-416.

[8] Akahane H, Sano M, Kobayashi M. Three cases of human gnathostomiasis caused by Gnathostoma hispidum. With particular reference to the identification of parasitic larvae[J]. Southeast Aaian J Trop Med Pubic Health, 1998, 29(3): 611.

[9] Herman J S, Chiodini P L. Gnathostoma, another emerging imported disease[J]. Clin Microbiol Rev, 2009, 22(3): 484-492.

[10] Lore V, Gluckman S J. Eosinophilic meningitis due to Gnathostoma spinigerum[J]. J Infect, 2002, 45(2): 117-120.

[11] 張鴻滿, 黎學(xué)銘, 歐陽頤, 等. 廣西首次發(fā)現(xiàn)顎口線蟲病[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2008, 14(5): 275-276.

[12] Huss H H, Ababouch L, Gram L. Assessment and management of seafood safety and quality[M]. Rome: FAO, 2003: 60-69.

[13] 李樹清, 李雯雯, 陳志飛, 等. 進(jìn)口黃鱔顎口線蟲檢疫及蟲種鑒定[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2011, 29(5): 81-85.

[14] 李雯雯, 李樹清, 張子群, 等. 黑龍江與廣州顎口線蟲幼蟲分離株的形態(tài)學(xué)觀察及其分子鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, (2): 104-107.

[15] Sugiyama H, Morishima Y, Kameoka Y,et al.Polymerase chain reaction (PCR)-based molecular discrimination between Paragonimus westermani and P. miyazakii at the metacercarial stage[J]. Mol Cell Probe, 2002, 16(3): 231-236.

DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX PCR ASSAY TO IDENTIFY GNATHOSTOMA SPINIGERUM, GNATHOSTOA NIPPONICUM AND GNATHOSTOMA DOLORESI

LI Shu-qing1, LI Wen-wen2, ZHANG Hong-man3,CHEN Shao-hong4, LI Jian5, CHEN Zhi-fei1, WANG Qiao-quan1, ZHANG Yong-nian4, HUANG Wei-yi5
(1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China; 2. Department of Animal Lab Center, First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China; 3. Guangxi Center for Disease Control and Prevention, Nanning 530021, China; 4. Chinese Center for Disease Control and Prevention, National Institute of Parasitic Diseases, Shanghai 200025, China; 5. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

Three pairs of primers specifc forG.spinigerum(JN408326),G.nipponicum(JN408315) andG.doloresi(JN408329) were designed based on their ITS-2 sequences. Accordingly, single and multiplex PCR methods were developed to identify Gnathostoma species. The amplif ed products in both single and multiplex PCR methods were 282 bp forG.spinigerum,358 bp forG.nipponicumand 183 bp forG.doloresi.The DNA detection limits were 0.2 ng forG.spinigerum,0.01 ng forG.nipponicumand also 0.01 ng forG.doloresi.No PCR products were amplified from genomes ofHysterothylacium, Anisakis, EchinostomaandSpirometra erinaceieuropaei.In addition, 12 species ofGnathostomaisolated from Philippines, Indonesia and Heilongjiang were identif ed in multiplex PCR and the results were in agreement with morphology and sequence analysis. The isolates from Philippines and Indonesia wereG.spinigerumand isolates from Heilongjiang wereG. nipponicum.These data suggested that multiplex PCR methods could be used for identifyingG. spinigerum, G. nipponicumandG. doloresi.

G.spinigerum; G.nipponicum ; G.doloresi;multiplex PCR; identif cation

S852.731

A

1674-6422（2014）06-0038-08

2014-07-11

上海市科委技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng)（11dz0503100 ）；國家質(zhì)檢總局科技專項(xiàng)（2010IK013）

李樹清，女，研究員，主要從事進(jìn)出境動物檢疫工作

李雯雯，E-mail：liwenwen.1027@163.com