古典H1N1亞型豬流感病毒反向遺傳操作平臺的建立

汪秀會，宮曉倩，劉曉敏，阮寶陽，李澤君，周艷君，童光志，于 海

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

古典H1N1亞型豬流感病毒反向遺傳操作平臺的建立

汪秀會，宮曉倩，劉曉敏，阮寶陽，李澤君，周艷君，童光志，于 海

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增古典H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8個(gè)目的基因片段，分別克隆至雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pBD上。將8個(gè)重組質(zhì)粒純化后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集上清，接種MDCK細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集MDCK細(xì)胞上清，其血凝效價(jià)為1:64，與原始野生株血凝效價(jià)一致；提取拯救病毒的RNA并進(jìn)行8個(gè)目的片段擴(kuò)增及序列分析，測序結(jié)果顯示與野生株病毒相同，表明病毒拯救成功。古典H1N1亞型豬流感病毒反向遺傳操作平臺的成功建立，不僅為探索流感病毒致病機(jī)理、感染機(jī)制及功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為H1N1亞型豬流感病毒新型疫苗的研制開辟了新的途徑。

RT-PCR；H1N1亞型；豬流感病毒；反向遺傳；病毒拯救

豬流感（swine influenza，SI）是由正黏病毒科、A型流感病毒屬的豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。臨床癥狀主要表現(xiàn)為咳嗽、流涕、噴嚏、高燒、昏睡、呼吸困難和食欲下降等[1]。大多在早春、深秋或者溫度驟變的情況下發(fā)生，特點(diǎn)為傳播速度快、發(fā)病率高，對仔豬特別是免疫力較差的仔豬致死率較高。同時(shí)，SIV還可以引起母豬的生殖障礙，育肥豬體重增長緩慢甚至減輕，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

SIV為單股負(fù)鏈RNA病毒， 可劃分為A、B、C三型，A型流感病毒又可劃分為不同的亞型，目前世界上普遍流行的亞型主要有H1N1、H1N2和H3N2三種亞型[2-4]。H1N1亞型SIV根據(jù)其基因片段的起源不同，可以劃分為古典豬H1N1亞型、禽源H1N1亞型和人源H1N1亞型[5]。SI 的歷史最早可追溯到1918年的美國，1931年首次成功分離并鑒定出古典H1N1 SIV[6]。1991年研究人員首次從我國豬群中分離獲得古典H1N1 SIV[7]。

反向遺傳操作技術(shù)是近年分子病毒學(xué)研究領(lǐng)域中備受矚目的一門新型技術(shù)。一般是指通過構(gòu)建病毒的基因組cDNA 克隆，在培養(yǎng)細(xì)胞或 /和易感宿主中重新“復(fù)活”病毒，通過基因插入、缺失等方法修飾病毒的基因組序列， 以此來進(jìn)行病毒的功能基因組研究、致病機(jī)理和新型疫苗的研制等[8-10]。本研究將構(gòu)建的SIV的8個(gè)基因片段分別克隆到pBD載體后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，組裝成有感染性的病毒粒子后接種MDCK細(xì)胞大量增殖，從而獲得拯救的SIV。

1 材料方法

1.1 毒株與載體質(zhì)粒古典H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011（H1N1）（簡稱G11）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；8質(zhì)粒流感病毒拯救系統(tǒng)雙向表達(dá)載體pBD由李澤君研究員提供。

1.2 菌種與細(xì)胞E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物有限公司；293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit、質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript III Frist-Strand購自Invitrogen公司；高保真酶Pfu Ultra Ⅱ購自Agilent公司；膠回收試劑盒購自上海華舜公司；捷瑞DNA Marker（DL 2000）、Bsp Q Ⅰ、T4 DNA Polymerase、T4 DNA ligase均購自NEB公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、OPTI-MEM培養(yǎng)基、TPCK-trypsion、Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)對GenBank中公布的H1N1亞型流感病毒5'和3'末端保守序列進(jìn)行比對，并參照文獻(xiàn)[11]，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的引物（見表1）及流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12，引物由gengray公司合成。

1.5 病毒RNA的提取及目的片段的擴(kuò)增按照QIAGEN RNeasy Mini Kit 說明書提取分離保存的雞胚尿囊液中的總RNA，按照Invitrogen SuperScript III Frist-Strand說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板，進(jìn)行SIV 8個(gè)質(zhì)粒的目的片段擴(kuò)增。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及純化將經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增的流感病毒8個(gè)目的片段、pBD載體分別用BspQⅠ酶切，酶切后產(chǎn)物核酸電泳，切取分子量大小相符的條帶進(jìn)行膠回收。回收的8個(gè)片段分別與酶切后的pBD表達(dá)載體在16℃連接儀內(nèi)過夜連接。連接產(chǎn)物（10μL）按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中，于37℃培養(yǎng)，對長出的菌落，提取重組質(zhì)粒并測序。對于序列正確的菌液進(jìn)行菌液擴(kuò)增，采用Plasmid Mini Kit I試劑盒提取質(zhì)粒，并測其濃度。

1.7 病毒的拯救8個(gè)質(zhì)粒按1μg計(jì)算，充分混勻于同一個(gè)EP管中，然后加入150μL無血清的OPTIMEM培養(yǎng)基，充分混勻。20μL Lipofectamine 2000與150μL無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基充分混勻后作用5min，然后加至混勻的質(zhì)粒中，室溫作用20min。將培養(yǎng)到最佳狀態(tài)的293T細(xì)胞用無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基洗1遍后，將上述混合物加至293T細(xì)胞的六孔板中，輕輕混勻。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，48h后收取上清。將收集到的上清接種到已培養(yǎng)好的MDCK細(xì)胞中，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集病毒。

1.8 救病毒的鑒定收集到的病毒上清進(jìn)行血凝（hemagglutination，HA）實(shí)驗(yàn)，測其血凝效價(jià)。同時(shí)將該細(xì)胞上清再次接種MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞病變明顯時(shí)，收集上清。利用此上清液，提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以該cDNA為模板擴(kuò)增拯救病毒的8個(gè)基因片段，并進(jìn)行基因片段的序列測定。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增片段結(jié)果以原始野生毒株提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增（圖1、2）?？梢钥闯?，通過RTPCR擴(kuò)增的8個(gè)基因片段的大小與理論相符。

圖1 野生株G11基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(1)Fig.1 RT-PCR products of wild strain G11 gene segments (1)

圖2 野生株G11基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(2)Fig.2 RT-PCR products of wild strain G11 gene segments (2)

2.2 重組pBD陽性質(zhì)粒鑒定結(jié)果8個(gè)基因片段與目的載體pBD連接后，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取孤立白色菌落進(jìn)行菌液增殖后鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的送Sangon Biotech公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與相應(yīng)序列一致。

2.3 病毒拯救鑒定結(jié)果

2.3.1 細(xì)胞病變觀察 將收集到的293T細(xì)胞上清接種到已培養(yǎng)好的MDCK細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況。圖3顯示，上清接種MDCK細(xì)胞后，細(xì)胞病變明顯。由此說明，病毒拯救成功，并命名為rG11。

2.3.2 血凝實(shí)驗(yàn)（HA) 由于病毒G11原始毒株的血凝效價(jià)較低，為1:64，MDCK細(xì)胞增殖1代后的血凝效價(jià)也不高，僅為1:4。因此將拯救出的病毒在MDCK細(xì)胞上接種至第2代，檢測其血凝效價(jià)與原始毒株的血凝效價(jià)相同，均為1:64。

圖3 拯救病毒接種MDCK細(xì)胞的病變(×100)Fig.3 The cytopathic effects (CPE) of MDCK cells inoculated with rG11 (×100)

2.3.3 拯救出的病毒片段擴(kuò)增 以拯救出的病毒為模板，重新進(jìn)行8個(gè)基因片段的擴(kuò)增，均能夠擴(kuò)出相應(yīng)條帶（圖4），且條帶與相應(yīng)片段的大小一致。序列測定結(jié)果表明，拯救的病毒與野生株病毒G11序列一致。由此進(jìn)一步證明病毒拯救成功。

圖4 rG11 8個(gè)基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 RT-PCR products of eight genes of rG11

3 討論

在豬的呼吸道上皮細(xì)胞同時(shí)存在流感病毒的兩種受體，即人流感病毒受體SAα-2、6-Gal和禽流感病毒受體SAα-2、3-Gal，因此豬既可以感染人流感病毒，也可感染禽流感病毒，是禽、豬、人流感病毒共同的易感宿主，被認(rèn)為是古老流感病毒存在的“貯存器”，以及生產(chǎn)新病毒的“混合器”[12,13]?，F(xiàn)有研究表明，SIV可以跨越種間屏障傳播給人[19]。因此研究SI除了顯而易見的獸醫(yī)傳染病學(xué)意義外，更具有極其重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[20]。預(yù)防SI的發(fā)生，抑制SIV的傳播，具有深遠(yuǎn)的意義。

反向遺傳操作技術(shù)的興起，推動了對RNA 病毒的研究。反向遺傳操作技術(shù)是相對于經(jīng)典遺傳學(xué)操作技術(shù)而言的一門新興技術(shù)，主要是在DNA分子水平上進(jìn)行體外操作，進(jìn)而研究RNA病毒和DNA病毒結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。本研究中所建立的古典H1N1亞型SIV反向遺傳操作技術(shù)平臺，是將隸屬于RNA病毒的SIV在提取RNA的基礎(chǔ)上反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在cDNA水平上進(jìn)行一系列的操作，包括利用pBD載體構(gòu)建SIV 8個(gè)陽性重組質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，接種MDCK細(xì)胞增殖病毒等。將轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞上清液接種到MDCK細(xì)胞上進(jìn)行病毒大量增殖，相對目前我國大部分研究將轉(zhuǎn)染后產(chǎn)物接種9～11日齡SPF雞胚[21,22]有明顯優(yōu)勢，即在節(jié)省孵育雞胚時(shí)間的同時(shí)，還大大降低了勞動強(qiáng)度，并且由于細(xì)胞能凍存、易復(fù)蘇、短時(shí)間可大量增殖等優(yōu)點(diǎn)，還大大節(jié)約了研究成本。細(xì)胞增殖除具有上述優(yōu)點(diǎn)外，還避免了病毒增殖后雞胚殘?bào)w焚燒帶來的環(huán)境污染，減少了人力勞動[23]。

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THE ESTABLISHMENT OF REVERSE GENETIC SYSTEM OF CLASSICAL H1N1 SWINE INFLUENZA VIRUS

WANG Xiu-hui, GONG Xiao-qian, LIU Xiao-min, RUAN Bao-yang, LI Ze-jun, ZHOU Yan-jun, TONG Guang-zhi, YU Hai
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Eight gene segments of Inf uenza virus A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1) were amplif ed by RT-PCR, separately cloned into the vector of pBD and then transfected together into 293T cells. The supernatant of 293T cells was collected after 48 hours and inoculated into MDCK cells. When cytopathic effects(CPE) appeared in MDCK cells, virus titer was determined at 1:64 in hemagglutination test, which was comparable to the original wild strain. Eight genes of the rescued viruses were amplif ed in RT-PCR and also conf rmed to be identical to the original virus. Therefore, rescued viruses were the same as the original inf uenza virus. The establishment of reverse genetic system of H1N1 subtype Swine influenza virus successfully, not only lay the foundation for exploring for the pathogenic mechanism, the infection mechanism and function, and so on, but also provide a basis for inf uenza vaccine of H1N1 swine inf uenza in the future.

RT-PCR; H1N1 subtype; Swine inf uenza virus; reverse genetics; virus rescue

S852.659.5

A

1674-6422（2014）06-0013-05

2014-08-15

國家青年自然科學(xué)基金（31201916）；上海市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（12ZR1453500）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程團(tuán)隊(duì)“動物流感病毒病原生態(tài)學(xué)”

汪秀會，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

于海，E-mail：haiyu@shvri.ac.cn；童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn