2012～2013年山東省禽源大腸桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)

孔令超，李志國，張瑞華，焦玉祥，馬明杰，郭翠平，朱巖麗，謝之景，姜世金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

·簡(jiǎn)報(bào)·

2012～2013年山東省禽源大腸桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)

孔令超，李志國，張瑞華，焦玉祥，馬明杰，郭翠平，朱巖麗，謝之景，姜世金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

為研究近年來山東省禽源致病性大腸桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥（plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR）基因的基因型分布，及其對(duì)喹諾酮類抗生素的耐藥性的影響，分別采用針對(duì)qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB與qepA 8個(gè)耐藥基因的通用引物，對(duì)93株2012～2013年分離自山東省的禽源大腸桿菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行了5種喹諾酮類藥物的藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明山東省禽源大腸桿菌對(duì)5種喹諾酮類抗生素均產(chǎn)生了較高耐藥性（50.54%～86.30%）；PMQR基因攜帶率達(dá)到60.21%（56/93），其中26.88%（25/93）的菌株攜帶2種PMQR基因，1.07%（1/93）的菌株攜帶3種PMQR基因；qnrA、qnrB、qnrC、qnrD與qepA基因未被檢測(cè)到，qnrS、oqxA和oqxB基因在山東省禽源致病性大腸桿菌中分布較為廣泛，其檢出率依次為22.58%（21/93）、40.86%（38/93）和24.73%（23/93）。

禽源致病性大腸桿菌；藥敏試驗(yàn)；質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥基因；PCR

喹諾酮類藥物是一類廣譜高效抗菌藥物，在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床中被廣泛應(yīng)用。已投入使用或即將進(jìn)入獸醫(yī)領(lǐng)域的藥物有10多種，主要有兩類，一類從人醫(yī)用移植轉(zhuǎn)化而來，如諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星等；另一類是動(dòng)物專用品種，己批準(zhǔn)上市的獸醫(yī)專用喹諾酮類藥物有德國拜耳公司生產(chǎn)的恩諾沙星、美國雅培公司生產(chǎn)的沙拉沙星和二氟沙星、美國輝瑞公司生產(chǎn)的單諾沙星、瑞士羅氏公司生產(chǎn)的麻保沙星、日本武田制藥生產(chǎn)的倍諾沙星以及日本大日本制藥生產(chǎn)的奧比沙星。近年來細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥率逐年上升，引起了人們的高度關(guān)注。喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要是引起細(xì)菌中染色體介導(dǎo)藥物作用靶位的改變、外膜通透性的改變以及外排泵過度表達(dá)[1]。

1998年，Martinez-Martinezd等[2]首次在一株肺炎克雷伯氏菌中存在的一個(gè)可介導(dǎo)喹諾酮類耐藥的質(zhì)粒pMG252上發(fā)現(xiàn)了qnrA基因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)qnr基因可在不同細(xì)菌中迅速水平傳播，其表達(dá)的Qnr蛋白能夠與喹諾酮類藥物以及喹諾酮類藥物的作用靶位相互作用，保護(hù)細(xì)菌的DNA解旋酶不被喹諾酮類藥物所抑制，從而產(chǎn)生耐藥。隨后，在中國、土耳其、美國、澳大利亞、德國、法國、韓國、意大利、日本等國家均發(fā)現(xiàn)了攜帶 qnr 基因的臨床分離大腸桿菌[3-11]。目前發(fā)現(xiàn)的qnr 基因包括 qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS，均為質(zhì)粒所攜帶，其中qnrA、qnrB和qnrS的一級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似[2,12-15]。

近年來，引起細(xì)菌耐藥的外排泵機(jī)制受到研究者的高度關(guān)注。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：OqxA和OqxB和QepA[16,17]。外排泵oqxA和oqxB基因可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)喹諾酮、喹乙醇、氯霉素的耐藥，二者是在豬源大腸桿菌的耐藥質(zhì)粒POLA52中發(fā)現(xiàn)的[16]。外排泵qepA基因則于2002年在日本兵庫縣病人尿液樣本中分離的大腸桿菌攜帶的耐藥質(zhì)粒pHPA中被發(fā)現(xiàn)，它可以介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類藥物、氟喹諾酮類藥物和廣譜內(nèi)酰胺酶類藥物的多重耐藥[17]。

為了解質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥（plasmid mediated quinolone resistance，PMQR）基因近年來在山東省禽源大腸桿菌中的流行和分布特點(diǎn)，本研究對(duì)2012～2013年間分離自山東省的93株禽源致病性大腸桿菌進(jìn)行了5種喹諾酮類藥物的藥敏試驗(yàn)，并對(duì)qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB與qepA 八個(gè)耐藥基因進(jìn)行了PCR 檢測(cè)，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株93株禽源致病性大腸桿菌為2012～2013年分離自山東省臨沂、泰安、濟(jì)寧、聊城、德州、棗莊6個(gè)市的11個(gè)規(guī)模化養(yǎng)禽場(chǎng)的病死禽，由山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.2 試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司；凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；pMD18-T載體、T4 DNA ligase、Taq酶和限制性內(nèi)切酶等購自大連寶生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、培氟沙星藥敏片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 PCR擴(kuò)增引物參照參考文獻(xiàn)[17-20]中的引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成分別針對(duì)qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB與qepA基因的通用引物（見表1），用于大腸桿菌PMQR基因型的檢測(cè)。

1.4 藥敏試驗(yàn)采用WHO推薦的紙片法（K-B法）對(duì)93株禽源致病性大腸桿菌進(jìn)行5種常用喹諾酮類抗生素（諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星和洛美沙星）的藥敏試驗(yàn)。

1.5 基因擴(kuò)增與測(cè)序以上述93株禽源大腸桿菌菌體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25 μL）如下：ddH2O 16.2 μL、10×Buffer (Mg2+free) 2.5 μL、MgCl2(25 mol/L) 2 μL、dNTP (2.5 mol/L) 2 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、菌液0.1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性50 s，根據(jù)每對(duì)引物的不同選擇不同的退火溫度退火45 s，72℃延伸60 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.6 基因測(cè)序隨機(jī)抽取部分PCR陽性樣品，將其PCR 產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌進(jìn)行陽性克隆的篩選，陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 普通藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)（CLSI2008）標(biāo)準(zhǔn)判定敏感率、中介率、耐藥率情況，藥敏試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。

表1 引物序列Table 1 The nucleotide sequence of the primers in this study

表2 93 株大腸桿菌對(duì)5種喹諾酮類藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The susceptibility test results of the 93 E. coli isolates to 5 kinds of quinolones

由表2可知山東省禽源致病性大腸桿菌對(duì)喹諾酮抗生素已普遍產(chǎn)生耐藥性。93株大腸桿菌對(duì)洛美沙星的耐藥率最高，達(dá)到86.30%（80/93），而對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星的耐藥率則依次降低，分別為61.64%、59.14%、54.84%和50.54%。

2.2 耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果及產(chǎn)物分析經(jīng)PCR檢測(cè)以及PCR陽性產(chǎn)物的克隆測(cè)序與分析，確定93株致病性大腸桿菌中有56株檢出產(chǎn)PMQR的耐藥基因，檢出陽性率為60.21%；其中30株僅攜帶1種PMQR基因，占所有菌株的32.26%；25株攜帶2種PMQR基因，占所有菌株26.88%；1株攜帶3種PMQR基因，占所有菌株的1.07%。93株禽源大腸桿菌僅檢測(cè)到了qnrS、oqxA和oqxB基因，檢出率依次為22.58%（21/93）、40.86%（38/93）和24.73%（23/93），而未檢出qnrA、qnrB、qnrC、qnrD與qepA基因型耐藥基因。93株禽源致病性大腸桿菌中攜帶PMQR基因的情況見表3。

表3 93株大腸桿菌中產(chǎn)PMQR基因攜帶情況Table 3 Prevalence of PMQR genes among the 93 E. coli isolates

11個(gè)家禽場(chǎng)中分離到的禽源致病性大腸桿菌中攜帶PMQR基因的情況（見表4）。其中qnrS基因在不同地區(qū)分離菌株中的檢出率為16.67%～33.33%，其中聊城市檢出率最高，棗莊市檢出率最低；oqxA基因在不同地區(qū)分離菌株中的檢出率為33.33%～50.00%，臨沂市檢出率最高，聊城市檢出率最低；oqxB基因在不同地區(qū)分離菌株中的檢出率為16.67%～33.33%，臨沂市檢出率最高，聊城市檢出率最低。結(jié)果說明這3種PMQR基因在山東省各個(gè)養(yǎng)禽場(chǎng)中分布已經(jīng)相當(dāng)普遍。3種耐藥基因在地域分布上沒有明顯的規(guī)律可循，推測(cè)這可能和不同地區(qū)用藥習(xí)慣性相關(guān)。

表4 11個(gè)養(yǎng)禽場(chǎng)大腸桿菌中產(chǎn)PMQR基因攜帶情況Table 4 Prevalence of PMQR genes among the E. coli isolates from 11 poultry-farms

2.3 耐藥表型與耐藥基因符合率結(jié)果對(duì)93株禽源致病性大腸桿菌對(duì)5種喹諾酮類抗生素的耐藥表型與攜帶PMQR基因的基因型之間的符合率進(jìn)行了分析：符合率=（PMQR基因檢出陽性菌株數(shù)/耐藥菌株數(shù)）×100%。結(jié)果表明耐藥基因型與耐藥表型之間符合率最高的為oqxA基因?qū)ε喾承牵瑸?0.85%；其次為oqxA型對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星與諾氟沙星，其符合率分別為74.51%、69.09%和66.67%；符合率最低的qnrS型對(duì)洛美沙星，為26.25%（見表5）。

表5 攜帶PMQR基因的大腸埃希菌的耐藥表型與基因的符合率Table 4 Coincidence rate of antimicrobial resistant phenotype and PMQR genes in E. coli isolates

qnrS、oqxA、oqxB這3種PMQR基因在對(duì)喹諾酮類藥物敏感和耐藥禽源致病性大腸桿菌中的檢出率結(jié)果表明，含與不含這3種PMQR基因的禽源致病性大腸桿菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物敏感率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示耐藥表型與PMQR基因型之間無明顯規(guī)律可循，這是因?yàn)榧?xì)菌抗喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，而PMQR基因主要引起細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的低水平耐藥。對(duì)洛美沙星等喹諾酮類藥物耐藥的菌株的耐藥基因型與耐藥表型之間符合率較低，推斷可能有其他其他耐藥基因或機(jī)制的存在。

近年來，PMQR基因引起的細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性引起了研究者的廣泛關(guān)注[2-17]。PMQR基因可在不同菌株甚至不同菌種之間迅速水平傳播，將會(huì)加快喹諾酮類藥物耐藥性在細(xì)菌間的傳播，從而導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)。PMQR基因常與其他多種耐藥基因共同整合，縮小了臨床醫(yī)生治療相關(guān)細(xì)菌感染時(shí)選藥或聯(lián)合用藥的空間[21,22]。目前，PMQR基因的廣泛存在已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到證實(shí)，各種基因的陽性率從1%～36%不等[23,24]。

家禽大腸桿菌病是獸醫(yī)上常見的重要細(xì)菌病之一，其發(fā)病率高、致死率高、經(jīng)濟(jì)損失大、治療難度大，因此對(duì)禽源大腸桿菌進(jìn)行PMQR基因檢測(cè)具有重意義。蘇晶等[25]曾對(duì)2004～2011年分離自山東省的230株禽源致病性大腸桿菌進(jìn)行了qnrA、qnrB和qnrS 三種基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果未檢出qnrA和qnrB基因，qnrS基因檢出率為16.52%（38/230）。本研究利用PCR方法對(duì)93株大腸桿菌中的8種PMQR基因進(jìn)行檢測(cè)及測(cè)序分析，結(jié)果僅檢測(cè)到了qnrS、oqxA和oqxB基因，檢出率依次為22.58%（21/93）、40.86%（38/93）和24.73%（23/93）。60.21%（56/93）的禽源致病性大腸桿菌中檢出PMQR基因，其中30株僅攜帶1種PMQR基因，25株攜帶2種PMQR基因，1株攜帶3種PMQR基因，顯示山東省禽源大腸桿菌中qnrS基因的攜帶率呈上升趨勢(shì)，而且PMQR基因型越來越呈現(xiàn)多樣性分布，需要在生產(chǎn)中加以高度重視。

喹諾酮類藥物是人工合成的具有4-喹諾酮環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，其主要抗菌機(jī)制是通過抑制細(xì)菌的脫氧核糖核酸旋轉(zhuǎn)酶（DNA解旋酶）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制而引起細(xì)菌死亡。目前，細(xì)菌尤其是大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生的耐藥問題已經(jīng)十分突出，主要耐藥機(jī)制是細(xì)菌染色體上編碼DNA解旋酶與拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致喹諾酮類藥物失去作用靶位、細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的改變以及相關(guān)的外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)，引起對(duì)喹諾酮類藥物的高水平耐藥[1]。這些耐藥基因和機(jī)制可能是耐藥基因型與耐藥表型之間符合率較低的重要原因，進(jìn)一步說明這些耐藥菌株中可能還存在其他的對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥基因或機(jī)制。

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DETECTION OF PLASMID-MEDIATED QUINOLONE RESISTANCE GENES IN AVIAN ESCHERICHIA COLI ISOLATES FROM SHANDONG PROVINCE IN 2012-2013

KONG Ling-chao, LI Zhi-Guo, ZHANG Rui-hua, JIAO Yu-xiang, MA Ming-jie, GUO Cui-ping, ZHU Yan-li, XIE Zhi-jing, JIANG Shi-jin
(Shandong Province Key Laboratory of Animal Biotechnology and Disease Control and Prevention, College of Veterinary Medicine, Shandong Agriculture University, Taian 271018, China )

To investigate the distribution of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes and their effect on the bacterial resistance to the quinolone antibiotics in recent years, qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, oqxA, oqxB and qepA genes of 93 avian E. coli strains isolated from Shandong Province were detected individually in PCR, and the resistance to Quinolones (Ciprofloxacin, Lomefl oxacin, Ofl oxacin, Norfl oxacin, Pefl oxacin) was detected in antimicrobial susceptibility test. Among 93 E. coli isolates tested, 47 (50.54%) to 80 (86.30%) strains were resistant to fi ve Quinolones respectively, and 56 (60.21%) strains were positive to PMQR genes. In addition, 25 isolates (26.88%) harbored two kinds of PMQR genes and 1 isolates (1.07%) harbored three kinds of PMQR genes. The positive rates of qnrS, oqxA and oqxB gene were 22.58% (21/93), 40.86% (38/93) and 24.73% (23/93) , respectively. None of qnrA, qnrB, qnrC, qnrD and qepA genes was detected.

Avian pathogenic Escherichia coli; drug susceptibility test; PMQR genes; PCR

S852.612

B

1674-6422（2014）04-0056-07

2014-02-14

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-13-011-15）

孔令超，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

姜世金，E-mail: sjjiang@sdau.edu.cn