乙型腦炎病毒基因組cDNA克隆在宿主菌中不穩(wěn)定因子的初步研究

鄭旭晨，鄭 浩，郭亦非，劉 飛，梁 超，童 武，單同領(lǐng)，于 海，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 20041）

·研究論文·

乙型腦炎病毒基因組cDNA克隆在宿主菌中不穩(wěn)定因子的初步研究

鄭旭晨，鄭 浩，郭亦非，劉 飛，梁 超，童 武，單同領(lǐng)，于 海，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 20041）

為了探求乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）基因組cDNA克隆在宿主菌中不穩(wěn)定遺傳的影響因子，本研究以豬源JEV HEN0701株基因組片段1～2913 bp為研究對象，分析基因組原核啟動子和相關(guān)毒力基因在不穩(wěn)定遺傳中的作用。在5'端，分析片段中潛在的原核啟動子序列，通過PCR擴(kuò)增得到不同長度的cDNA片段；在3'端，通過內(nèi)切酶酶切截斷基因組prM蛋白或E蛋白編碼區(qū)，獲得3'末端不同的cDNA片段。將各片段克隆入pCR-BluntII-TOPO載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，于37℃條件下培養(yǎng)。結(jié)果顯示，片段73～2913 bp、97～2913 bp、355～2913 bp及1～933 bp、1～1275 bp能夠在轉(zhuǎn)化菌中穩(wěn)定遺傳；含有其他片段39～2913 bp、54～2913 bp及1～1800 bp、1～1971 bp的重組細(xì)菌不能在37℃條件下生長；片段1～1600 bp雖然能夠在轉(zhuǎn)化菌中傳代，但是出現(xiàn)不規(guī)律突變。以上結(jié)果表明：軟件所預(yù)測各原核啟動子片段中，基因組73～118 bp區(qū)域與cDNA克隆穩(wěn)定性有關(guān)，且上游的54 bp至73 bp的序列對該區(qū)域啟動子存在影響；在JEV基因組1275 bp至1600 bp之間可能存在毒性蛋白編碼序列。

乙型腦炎病毒；遺傳不穩(wěn)定性；潛在啟動子；毒性蛋白編碼序列位置

乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種急性流行性病毒性腦炎。JEV為蟲媒病毒，是黃病毒科黃病毒屬（Flavivirus）成員，通過侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)病毒性腦炎[1]。人、豬、馬和野生水禽均可感染。其中，豬為JEV最主要的擴(kuò)大宿主，感染發(fā)病后，其臨床癥狀表現(xiàn)為新生仔豬腦炎和種豬的繁殖障礙；水禽為JEV的攜帶宿主；人為JEV的終末宿主，特別是兒童，感染發(fā)病后，死亡率可高達(dá)25%，而50%的幸存者將發(fā)展為永久性腦炎后遺癥，危害嚴(yán)重[2,3]。

反向遺傳操作系統(tǒng)的建立是深入研究JEV的基礎(chǔ)，但JEV cDNA克隆在宿主菌中具有遺傳不穩(wěn)定性，成為構(gòu)建JEV cDNA的一大障礙，使得JEV反向遺傳操作平臺難以建成。其遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)為載有病毒cDNA克隆的宿主菌株死亡，或者病毒cDNA克隆發(fā)生外源序列的插入和核苷酸的缺失[4,5]。人們對于病毒cDNA克隆無法穩(wěn)定遺傳的原因知之甚少，普遍認(rèn)為，原因之一是病毒克隆所表達(dá)的基因產(chǎn)物對宿主菌具有毒性[5]。我們相信，JEV基因組cDNA克隆在宿主菌中穩(wěn)定與否，與cDNA克隆在宿主菌中所表達(dá)的毒性蛋白以及調(diào)控該蛋白表達(dá)的啟動子活性有關(guān)。因此，本研究選取基因I型豬源乙型腦炎病毒HEN0701株[6]，以其基因組1～2913位核苷酸序列片段作為研究對象，尋找潛在啟動子活性區(qū)及毒性蛋白編碼序列在JEV基因組中的位置，以期找到穩(wěn)定繁殖JEV重組質(zhì)粒的方法，克服由于發(fā)生突變導(dǎo)致的JEV cDNA克隆不具備感染性的難點。

1 材料與方法

1.1菌株、毒株、質(zhì)粒大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購自北京TIANGEN生物公司；豬源JEV基因I型HEN0701株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病實驗室（以下簡稱本實驗室）保存；質(zhì)粒pTHENC1為將HEN0701株基因組1～2913位核苷酸克隆入pCR-BluntII-TOPO載體，其方法見文獻(xiàn)[6]。

1.2 主要試劑LB固體培養(yǎng)基；LB液體培養(yǎng)基；卡那霉素；小量質(zhì)粒快速提取純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；PfuUltraTMHotstart High-Fidelity DNA Polymerase購于Stratagene公司；pCR-BluntII-TOPO購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計與合成使用軟件Primer Premier 5.0，參照Genbank中HEN0701株基因組序列，設(shè)計引物（見表1），并由上海英駿生物技術(shù)公司合成。

1.4 尋找JEV基因組中可能具有原核啟動子活性的序列區(qū)段利用Berkeley Drosophila Genome Project中的Neural Network promoter prediction軟件（http://www. fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）對HEN0701株1～2913位核苷酸序列進(jìn)行分析，在線預(yù)測該段序列中具有原核啟動子序列特征的序列區(qū)段。針對所預(yù)測序列區(qū)段設(shè)計引物， PCR擴(kuò)增pTHENC1，獲得具有不同5'端的cDNA片段，插入pCR-BluntII-TOPO載體，構(gòu)建缺少JEV 基因組1～2913 bp片段5'端部分序列的重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃培養(yǎng)，對長出的菌落，提取重組質(zhì)粒并測序。

1.5 定點突變潛在的原核啟動子序列利用軟件The Mfold Web Server（http://mfold.rna.albany. edu/?q=mfold）對HEN0701株RNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析，在不改變該二級結(jié)構(gòu)的前提下，通過PCR定點突變的方法對潛在啟動子活性區(qū)序列進(jìn)行定點突變，得到突變質(zhì)粒。將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，觀察細(xì)菌生長狀況并測定克隆序列。

1.6 尋找毒性蛋白序列位置利用JEV及pCR-BluntIITOPO基因組中合適的酶切位點，以pTHENC1為模板，對JEV E蛋白和prM蛋白編碼序列不同位置進(jìn)行切割，剩余片段重新自連，構(gòu)建缺少JEV 基因組1～2913 bp片段中3'端部分序列的克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，37℃培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒測定克隆序列。

表1 引物序列Table 1 The sequence of the primers

2 結(jié)果

2.1 潛在原核啟動子序列在JEV基因組中的位置在線分析結(jié)果顯示，在JEV基因組1～2913位核苷酸序列中，評分在0.8分以上的可能具有原核啟動子活性的序列共有7段，分別為73～118 bp、305～350 bp、1045～1090 bp、1330～1375 bp、1348～1393 bp、1695～1740 bp、2090b～2135 bp，命名為P1～P7（見表2）。根據(jù)P1～P7位置，PCR擴(kuò)增pTHENC1，從HEN0701株5'端不同位置起始至2913 bp為止（分別為355～2913 bp、97～2913 bp、73～2913 bp、54～2913 bp、39～2913 bp），構(gòu)建各重組質(zhì)粒，分別命名為pTHENO355、pTHENO97、pTHENO73、pTHENO54、pTHENO39。將所構(gòu)建的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，37℃培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTHENO355、pTHENO97、pTHENO73能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定遺傳，而pTHENO54和pTHENO39轉(zhuǎn)化大腸桿菌后轉(zhuǎn)化菌不能生長（見表3）。可見，序列P1可能與cDNA克隆穩(wěn)定性相關(guān)，其上游的 54～73 核苷酸序列對P1的活性存在影響。因此，對于pTHENO355和pTHENO97，P1的序列結(jié)構(gòu)被破壞后，雖保持了所預(yù)測其他各潛在啟動子序列結(jié)構(gòu)的完整性，由于P1所控制的毒性蛋白的表達(dá)被阻礙，JEV基因組對宿主菌株的毒害作用減弱，JEV基因組得以穩(wěn)定遺傳；pTHENO54和pTHENO39所載目的序列則保持了P1序列結(jié)構(gòu)的完整，P1控制對宿主菌有毒害作用的相關(guān)蛋白的表達(dá)，使得JEV基因組無法穩(wěn)定遺傳；而對于pTHENO73，雖具有完整P1序列結(jié)構(gòu)，仍然不能穩(wěn)定遺傳，說明JEV基因組54～73 bp序列對P1的功能產(chǎn)生一定影響。

表2 潛在啟動子預(yù)測結(jié)果Table 2 Predicted prokaryotic promoters within nt 1 to 2913 of the HEN0701 genome

表3 缺少5'端部分序列的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的遺傳情況Table 3 Genetically stability of recombinant plasmids lacking sequences at 5'terminus in E.coli

2.2 PCR定點突變對JEV cDNA克隆穩(wěn)定性有影響的序列區(qū)段根據(jù)RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，通過PCR定點突變的方法，在JEV 54～118 bp區(qū)段內(nèi)富含A/U的區(qū)域選取位置進(jìn)行定點突變。分別于66 bp及69 bp處同時做U-C及A-G突變、76 bp處做U-C突變、90 bp處做A-C突變、105 bp處做A-G突變，共構(gòu)建了4種突變克隆（見圖1），4種突變克隆都不能在E.coli中穩(wěn)定遺傳。據(jù)報道，Pu等[7]對JEV RP-9株基因組序列進(jìn)行分析，預(yù)測出在JEV基因組中具有大腸桿菌啟動子活性的序列區(qū)段，在該區(qū)段中90 bp處做A-C定點突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該突變可以有效降低大腸桿菌啟動子活性，并成功構(gòu)建出在37℃條件下能穩(wěn)定在宿主菌中擴(kuò)增的JEV全長感染性克隆。本研究對90 bp處進(jìn)行A-C定點突變所獲突變克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 TOP10感受態(tài)細(xì)胞后，克隆在37℃條件下培養(yǎng)會于其他位置發(fā)生點突變，仍然不能穩(wěn)定生長。這說明，90 bp處的突變不能影響本毒株cDNA克隆在E.coli中的遺傳不穩(wěn)定性。

2.3 毒性蛋白序列在JEV基因組中的位置在初步研究中發(fā)現(xiàn)，HEN0701株易于在E蛋白編碼基因區(qū)域發(fā)生突變[13]。本研究利用JEV基因組和pCRBluntII-TOPO載體中合適的酶切位點，將pTHENC1中HEN0701序列的3'端部分序列切除，剩余片段自我連接成新的重組質(zhì)粒。這些重組質(zhì)粒分別攜帶有JEV基因組序列的1～933 bp、1～1275 bp、1～1600 bp、1～1800 bp、1～1971 bp片段，依次命名為：pTHENE933、pTHENE1275、pTHENE1600、pTHENE1800、pTHENE1971。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10并在37℃條件下培養(yǎng)，測序結(jié)果表明，pTHENE933和pTHENE1275能夠在37℃條件下于大腸桿菌中穩(wěn)定遺傳，而pTHENE1600、pTHENE1800、pTHENE1971轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，不能穩(wěn)定遺傳（見表4）。這說明，在1275～1600 bp之間可能存在毒性蛋白編碼序列。在1600 bp下游進(jìn)行的酶切反應(yīng)沒有破壞JEV基因組中的毒性蛋白基因，因此對毒性蛋白的表達(dá)沒有影響，毒性蛋白毒害宿主菌，導(dǎo)致JEV cDNA不具備遺傳穩(wěn)定性。而在1275 bp上游進(jìn)行的酶切反應(yīng)，破壞了3'端毒性蛋白編碼序列的結(jié)構(gòu)，使得JEV基因組對大腸桿菌的毒害作用減弱，保證了宿主菌的正常生長和JEV基因組的穩(wěn)定遺傳。

圖1 JEV HEN0701 RNA二級結(jié)構(gòu)整體示意圖（A）及主要研究區(qū)域示意圖（B）Fig.1 Modelled RNA structure for global (A) and local (B) of JEV HEN0701 strain

表4 缺少3'端部分序列的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的遺傳情況Table 4 Genetically stability of recombinant plasmids lacking sequences at 3'terminus in E.coli

3 討論

在亞洲，每年有133 000以上的兒童患有急性腦炎綜合征（acute encephalitis syndrome，AES），其中1/4為乙型腦炎患者[8]。豬可以迅速復(fù)制JEV并表現(xiàn)出極強(qiáng)的病毒血癥，在JEV傳播過程具有重要作用。特別在近幾十年來，豬的集約化工業(yè)化養(yǎng)殖得到大力發(fā)展（如中國、緬甸、泰國、越南），使得JEV傳播在密集化豬群中產(chǎn)生放大效應(yīng)，加大了JEV傳播的風(fēng)險，這成為人感染JEV的主要因素[9]，因此對豬乙型腦炎病毒進(jìn)行深入研究意義重大。

本次研究對象HEN0701株為豬源GI型JEV，在對其進(jìn)行分段克隆過程中，發(fā)現(xiàn)1～2913位核苷酸序列在大腸桿菌中最易發(fā)生突變，因此選取這一段進(jìn)行cDNA克隆不穩(wěn)定因子的研究。我們認(rèn)為，影響JEV cDNA克隆穩(wěn)定性的因素有以下三點：第一，宿主菌株和培養(yǎng)溫度等外界因素對cDNA克隆的影響；第二，JEV基因組中極易發(fā)生插入、缺失和點突變的位置實為JEV序列高變區(qū)，是序列自身特性決定了其cDNA克隆難以穩(wěn)定遺傳；第三，JEV基因組具有能在宿主菌中發(fā)揮啟動子活性的序列，能夠啟動某些對宿主菌株有毒害作用的JEV蛋白的表達(dá)。在研究初期，我們排除了外因的影響，認(rèn)為宿主菌株對cDNA克隆穩(wěn)定性的影響不顯著，低溫培養(yǎng)可以克服克隆序列的不穩(wěn)定[4]。同時，PCR擴(kuò)增除5'UTR以外的連續(xù)序列，即97～2913 bp序列片段，該片段包含極不穩(wěn)定的序列區(qū)域，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在宿主菌中穩(wěn)定遺傳，這否定了高變區(qū)存在于JEV基因組中的可能性。因此認(rèn)為，JEV基因組中具有原核啟動子活性的序列可能對cDNA克隆的穩(wěn)定性具有影響。

研究表明，在JEV基因組1～2913 bp序列中，包含有具有原核啟動子序列特征的序列。經(jīng)過對這些序列的研究，我們篩選出對cDNA克隆穩(wěn)定性存在影響的序列為所預(yù)測的第一段潛在原核啟動子序列，即73～118 bp序列，上游54～73 bp對該序列的功能有影響。因此，針對該區(qū)段進(jìn)行定點突變，期望在不改變RNA二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，降低所預(yù)測的潛在啟動子的活性，以達(dá)到穩(wěn)定克隆的目的。分析發(fā)現(xiàn)，在此段序列中具有富含A/U區(qū)域，相信這些特殊區(qū)域?qū)π蛄邪l(fā)揮啟動子功能具有重要意義。在這些區(qū)域中選取位置進(jìn)行突變，卻沒有取得預(yù)期結(jié)果，說明這些位置對克隆的穩(wěn)定性沒有影響。另外，我們在E蛋白編碼區(qū)中找到了毒性蛋白的序列位置在1297～1600 bp之間。本研究為后續(xù)反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

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PRELIMINARY STUDY ON GENETIC INSTABILITY OF JAPANESES ENCEPHALITIS VIRUS CDNA CLONE TRANSFORMED IN ESCHERICHIA COLI

ZHENG Xu-chen, ZHENG Hao, GUO Yi-fei, LIU Fei, LIANG Chao, TONG Wu, SHAN Tong-ling, YU Hai, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 20041, China)

In the present study, a series of fragments from 1 to 2913 bp were generated from Japanese encephalitis virus (JEV) HEN0701genome in order to explore factors affecting genetic instability of cDNA clone when propagated in E. coli. These cDNA fragments were obtained using either PCR starting at 5' terminus or restriction enzyme digestion at different positiosn of 3' terminus. Each fragment was cloned into pCR-BluntII-TOPO vector and transformed into E. coli cultures, then were incubated at 37℃. Fragments 73 to 2913 bp, 97 to 2913 bp, 355 to 2913 bp and 1 to 933 bp, 1 to 1275 bp showed stability during passages of the transformed bacteria. However, recombinant bacteria containing fragments of 39 to 2913 bp, 54 to 2913 bp and 1 to 1800 bp, 1 to 1971 bp did not grow at 37℃. In addition, fragment 1 to 1600 bp of JEV genome was passaged in transformed bacteria but mutation occurred. The above results indicated that the fragment 73 to 118 bp affected the stability of JEV cDNA clone. The upstream sequences at 54 to 73 bp might be involve in this process as well. The results also suggest that toxic protein coding sequence might exist between 1275 to 1600 bp of JEVgenome.

Japanese encephalitis virus (JEV); genetic instability; potential prokaryotic promoter; toxic protein coding sequence position

S852.659.6

：A

：1674-6422（2014）04-0017-06

2014-01-14

上海市自然基金項目（11ZR1446200）；國家自然基金青年基金項目（31201917）；上海市重點科技攻關(guān)項目（09391910800）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目（2012JB08）

鄭旭晨，女，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn